哺乳動(dòng)物包括人的精子和卵子都沒(méi)有獨(dú)立發(fā)育成個(gè)體的能力，只有精卵結(jié)合形成合子，即受精，才賦予精子和卵子能發(fā)育成為新個(gè)體的潛能，所以，受精是哺乳動(dòng)物新生命的起點(diǎn)。在生理?xiàng)l件下，精子必須先經(jīng)過(guò)雌性生殖管道并停留一段時(shí)間后，才能獲得使卵子受精的能力。Austin和張明覺(jué)將該現(xiàn)象稱之為精子獲能（capacitation）。獲能后的精子穿透卵子的外衣，包括卵丘的放射冠、透明帶；精卵膜結(jié)合、融合；卵子激活；最終實(shí)現(xiàn)精卵核融合，完成受精（fertilization）。

正常情況下，一次射精精液量約數(shù)毫升，有上億甚至數(shù)億精子射入陰道。開(kāi)始時(shí)，精液呈凝固膠凍狀，約在15～30分鐘后，凝固的精液在纖溶酶系統(tǒng)作用下，達(dá)到完全液化。其中僅有一小部分精子能進(jìn)入子宮頸，開(kāi)始在女性生殖管道中的運(yùn)行。而后精子進(jìn)入子宮腔，再到達(dá)輸卵管，并在女性生殖管道運(yùn)行過(guò)程中獲能，最后在輸卵管壺腹部與卵子相遇，并使之受精（圖9-1）。精子在女性生殖管道中的運(yùn)行，除了精子本身的運(yùn)動(dòng)（特別是活躍的前向運(yùn)動(dòng)）和生殖管道的收縮作用外，還受到女性生殖道結(jié)構(gòu)因素、宮頸黏液因素和精子趨化因子等因素的影響。

陰道pH一般為4～5，酸度很高，對(duì)精子存活不利。如果精液體積足夠，且pH為7以上，其在短時(shí)間內(nèi)對(duì)陰道環(huán)境可起緩沖作用，陰道pH可升至6以上，即酸度有所降低，但一般也只能維持半小時(shí)左右，如在半小時(shí)內(nèi)精子未穿入宮頸黏液一般均死亡。

在排卵前期，宮頸管口已開(kāi)啟，宮頸黏膜腺體在雌激素作用下，分泌旺盛，宮頸黏液不僅豐富，而且宮頸黏液中水分含量增高，流動(dòng)性增大，pH增高。宮頸黏液通過(guò)開(kāi)啟的宮頸口緩緩流出，這時(shí)精子能有效地和宮頸口黏液接觸，逆流而上進(jìn)入宮頸管，其中一部分精子進(jìn)入宮頸的黏膜隱窩系統(tǒng)，另一部分精子則繼續(xù)上游。進(jìn)入宮頸黏膜隱窩系統(tǒng)的精子存活條件良好，有可能逐步釋放出來(lái)，加入上游行列。在性生活或人工授精后30分鐘，宮頸管宮頸黏液中充滿了運(yùn)動(dòng)活躍的精子，同時(shí)在宮腔中也有相當(dāng)數(shù)量精子，甚至在輸卵管中也可能會(huì)見(jiàn)到少數(shù)幾個(gè)精子。在數(shù)小時(shí)后有精子到達(dá)輸卵管峽部，其中有少量精子繼續(xù)上行到達(dá)輸卵管壺腹部，甚至有極少精子通過(guò)傘部進(jìn)入腹腔，而相當(dāng)一部分精子則滯留于輸卵管峽部精子貯存區(qū)。輸卵管峽部含有黏稠分泌物，它可起到滯留精子的作用；另外精子膜表面糖基與輸卵管峽部上皮細(xì)胞游離面的糖基相互識(shí)別、結(jié)合，使精子頭部黏附于輸卵管峽部黏膜的上皮細(xì)胞以滯留精子，這樣輸卵管峽部就成為精子貯存區(qū)。輸卵管峽部精子貯存區(qū)具有重要生理意義，主要包括：①限制進(jìn)入輸卵管壺腹部的精子數(shù)量，預(yù)防多精受精。②維持精子活力，以備精子受精。精子在宮頸、子宮腔的運(yùn)行過(guò)程中，也與其黏膜上皮細(xì)胞相接觸，精子也可能沉積在相應(yīng)部位，但在輸卵管峽部的這種作用更為重要。③參與對(duì)精子獲能的調(diào)節(jié)。精子黏附于輸卵管上皮細(xì)胞能延緩精子獲能，這對(duì)精子獲能在體內(nèi)適時(shí)進(jìn)行具有重要作用。有研究表明黏附于上皮細(xì)胞的精子，其細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度比游離狀態(tài)的精子低2～3倍，精子獲能延緩可能與此相關(guān)。

精子與輸卵管峽部黏膜上皮細(xì)胞的黏附只是暫時(shí)的。精子能脫離上皮，繼續(xù)上行而進(jìn)入輸卵管壺腹部，參與受精。精子如何從貯存區(qū)釋放，其機(jī)制尚不清楚。早期研究證實(shí)，輸卵管上皮所處的激素環(huán)境是影響精子釋放的關(guān)鍵因素。有實(shí)驗(yàn)顯示，激素環(huán)境發(fā)生變化并不影響?zhàn)つど掀ど吓c精子特異結(jié)合的位點(diǎn)。而獲能精子與輸卵管黏膜上皮的黏附率卻顯著低于未獲能精子。這表明精子自身狀態(tài)決定了精子-黏膜上皮的相互結(jié)合能力。結(jié)合資料可以推測(cè)，當(dāng)體內(nèi)激素環(huán)境改變后，輸卵管上皮細(xì)胞的分泌功能也隨之發(fā)生變化。在排卵期內(nèi)，輸卵管黏膜上皮細(xì)胞可能分泌某種物質(zhì)，該物質(zhì)使黏附于黏膜上皮細(xì)胞的精子獲能。精子獲能后，其質(zhì)膜發(fā)生了一系列的相應(yīng)變化，失去了精子-黏膜上皮相互結(jié)合的分子基礎(chǔ)。同時(shí)，獲能精子還具有超活化運(yùn)動(dòng)能力，其強(qiáng)有力的鞭打樣運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了精子頭部脫離輸卵管上皮表面的力量。

精子在女性生殖管道中的運(yùn)行主要取決于生殖管道的結(jié)構(gòu)、分泌活性及其收縮活動(dòng)。生殖管道的分泌活性以及收縮活動(dòng)都受卵巢激素調(diào)控，故卵巢激素對(duì)精子運(yùn)行有十分重要的影響。生殖管道的收縮活動(dòng)還受交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)支配；縮宮素、前列腺素對(duì)其也有作用，所以上述因素對(duì)精子的運(yùn)行都有一定影響。

雖然射入陰道的精子數(shù)以億計(jì)，但是能到達(dá)輸卵管壺腹部接近卵子的精子數(shù)量極少，在人類大約有數(shù)十個(gè)至200個(gè)。絕大多數(shù)精子在陰道、子宮頸、輸卵管峽部等區(qū)域沉積死亡，包括進(jìn)入受精部位的精子在未受精后也很快死亡。精子在女性生殖管道中存活時(shí)間十分有限。有報(bào)道稱，精子在女性生殖管道中平均存活時(shí)間分別為：陰道半小時(shí)至2.5小時(shí)，宮頸48小時(shí)，子宮24小時(shí)，輸卵管48小時(shí)；而精子受精能力的喪失可能較失去存活力的時(shí)間更早。

精子自身因素特別是精子運(yùn)動(dòng)障礙或女性生殖道不通暢，甚至阻塞因素會(huì)妨礙精子在女性生殖道中的運(yùn)行。宮頸分泌的宮頸黏液異常也使精子在女性生殖道中運(yùn)行的啟動(dòng)發(fā)生困難，從而會(huì)引起宮頸性不育癥（cervical sterility）。據(jù)報(bào)告在不育夫婦中，由宮頸黏液因素引起的不育癥占15%～20%。男科醫(yī)師在診治不育工作中對(duì)此應(yīng)有基本的了解。

宮頸黏液異常可表現(xiàn)為宮頸黏液量的減少，有些育齡不育婦女常呈現(xiàn)宮頸黏液量恒定的不足，即使在排卵前期也僅有少量宮頸黏液。究其原因，或是種種原因造成了宮頸黏液腺體結(jié)構(gòu)上的損害，使宮頸黏膜菲薄，甚至萎縮；或是由于雌激素刺激不足，或雖然雌激素正常，但宮頸黏液腺分泌細(xì)胞對(duì)雌激素缺乏敏感性。有的則主要表現(xiàn)為宮頸黏液質(zhì)的異常，這種類型的患者由于宮頸黏液腺體的反復(fù)感染或物理化學(xué)因素造成局部無(wú)菌性損害，從而影響宮頸黏液物理化學(xué)特性的改變，致使黏液黏稠，呈黃色，不形成結(jié)晶，pH降低等，這些均會(huì)對(duì)精子運(yùn)行及穿透宮頸黏液造成障礙，導(dǎo)致宮頸黏液形成網(wǎng)眼收縮，精子不易通過(guò)，或精子被巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞大量吞噬，或精子表面黏附著某些細(xì)菌，不利游動(dòng)。宮頸黏液存在抗精子抗體則更為常見(jiàn)，在這種情況下就像在宮頸口形成了一道重要屏障，阻擋精子通過(guò)，拒精子于宮頸口外。

精子趨化性（chemotaxis）是在海膽受精研究中首先提出的。研究者發(fā)現(xiàn)，排入海水中的海膽卵子釋放某種物質(zhì)即趨化劑；該物質(zhì)能誘導(dǎo)海膽精子沿其化學(xué)梯度運(yùn)動(dòng)，從而使精子接近卵子，實(shí)現(xiàn)受精。這種精子運(yùn)動(dòng)方向受趨化劑調(diào)節(jié)的現(xiàn)象稱之為精子趨化性。精子趨化最終會(huì)導(dǎo)致精子聚集于某特定的部位，但它不同于精子運(yùn)動(dòng)激活（chemokinesis）和精子誘捕（trapping）所造成的精子聚集。精子運(yùn)動(dòng)激活和精子誘捕都與精子運(yùn)動(dòng)方向變化無(wú)關(guān)。體外受精動(dòng)物的配子在外環(huán)境中高分散，那么趨向性對(duì)其來(lái)說(shuō)則至關(guān)重要。在水蛋（water egg）中分離出了一些小肽，這些肽除了促進(jìn)精子的運(yùn)動(dòng)和呼吸，還起到物種特異性的化學(xué)吸引力。特別是呼吸活化肽（resact），能誘導(dǎo)精子從圓形向直線形運(yùn)動(dòng)軌跡改變。當(dāng)鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶與resact合后，鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的活性瞬間被激活，環(huán)鳥(niǎo)苷酸（cGMP）開(kāi)始合成。有人推測(cè)cGMP能選擇性打開(kāi)離子通道釋放鉀離子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平最后超激活精子，使其直線運(yùn)動(dòng)。最近還提出了cGMP充當(dāng)精子與化學(xué)引誘物之間的信號(hào)轉(zhuǎn)換器的觀點(diǎn)。海膽精子通過(guò)cGMP激活鉀離子通道使鉀離子外泄，與此同時(shí)打開(kāi)鈣離子通，進(jìn)而使精子細(xì)胞膜超極化。鈣離子的進(jìn)入是調(diào)節(jié)精子趨向性的重要因素，并且這似乎是所有物種的共同特征。

關(guān)于哺乳動(dòng)物包括人的受精過(guò)程是否存在精子趨化現(xiàn)象，一直有爭(zhēng)論。反對(duì)者認(rèn)為，哺乳動(dòng)物受精是在雌性生殖管到中進(jìn)行的，射入雌性生殖管道的精子數(shù)量極大，有足夠量的精子能夠順利到達(dá)受精部位，故精子趨化性對(duì)受精并非必需。然而以下一些實(shí)驗(yàn)證據(jù)又間接表明，哺乳動(dòng)物受精也存在精子趨化現(xiàn)象。①進(jìn)入兩側(cè)輸卵管峽部的精子數(shù)量基本相等，但到達(dá)輸卵管壺腹部的精子數(shù)量不同，有卵子側(cè)輸卵管壺腹部的精子數(shù)量顯著高于無(wú)卵子側(cè)。其中，排卵時(shí)卵子的分泌物可能是導(dǎo)致精子上行至輸卵管壺腹部的關(guān)鍵因素。②在一些哺乳動(dòng)物中，精子會(huì)存儲(chǔ)在尾峽部且活動(dòng)力降低，并在排卵后恢復(fù)活動(dòng)力。在人類，精子存儲(chǔ)在女性的子宮頸；然而，精子和卵子的受精比例為10∶1至1∶1，表明在女性生殖道可能就發(fā)生了精子的選擇。事實(shí)上，當(dāng)排卵發(fā)生時(shí)，一些儲(chǔ)存的精子恢復(fù)活力，并在幾分鐘內(nèi)到達(dá)受精部位。儲(chǔ)存的精子被釋放后立即能從上皮中分離，表明這些精子接收了來(lái)自輸卵管的信號(hào)。此后又有大量體外研究證實(shí)了哺乳動(dòng)物，至少是人和小鼠存在精子趨化性的事實(shí)。

卵泡液（FF）包含卵子和卵丘的分泌物，有受精能力卵子的FF可以作為趨化物，可見(jiàn)成熟卵子和周圍卵丘細(xì)胞是兩個(gè)真正的趨化源。FF中的肽、肝素、激素等許多物質(zhì)被認(rèn)為是潛在趨化物，但只有黃體酮已明確是由人類卵丘細(xì)胞分泌，并能引起人類精子積累的趨化物。分子量為8KD的蛋白質(zhì)RANTES也是人類精子的趨化物，存在于卵泡液中，由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，并且在人類精子中有其受體mRNA的表達(dá)。如果RANTES是人類精子生理學(xué)的趨化物，則顆粒細(xì)胞是除卵丘細(xì)胞外，又一種產(chǎn)生趨化物的細(xì)胞類型。有趣的是，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)嗅覺(jué)受體也在趨化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。hOR17-4就是表達(dá)于哺乳動(dòng)物精子上的G-蛋白耦聯(lián)的嗅覺(jué)受體，Bourgeonal作為hOR17-4的配體，能引起人類的精子發(fā)生趨化性運(yùn)動(dòng)，另外一個(gè)嗅覺(jué)受體——lyral，可引起小鼠的精子發(fā)生趨化性運(yùn)動(dòng)。而這兩種受體的配體至今尚未有人證明其存在于卵泡液中，是否存在天然的配體現(xiàn)在還不是很清楚。

就特定的精子群體而言，能發(fā)生趨化性的精子僅占其一小部分，在人類約為1%至12%，在小鼠約為10%。每個(gè)精子對(duì)趨化劑的應(yīng)答時(shí)間都十分短暫，并且只能發(fā)生一次應(yīng)答。有研究表明，人的精子只在特定生理階段才選擇性地表現(xiàn)趨化性，這提示人精子趨化性可能與精子獲能狀態(tài)相關(guān)。此外，人們還觀察到，同一群體中的人精子趨化性并不同時(shí)發(fā)生，有先有后，精子獲能也是如此。而同一群體中發(fā)生趨化性的精子比例近似于發(fā)生獲能的精子比例等。這進(jìn)一步表明精子趨化性與精子獲能密切相關(guān)。

精子在雌性生殖管道中的運(yùn)行，經(jīng)歷了子宮頸、子宮、輸卵管等器官，精子趨化劑不可能在所有器官中都形成有效的化學(xué)梯度，只可能在相對(duì)短的合適距離內(nèi)形成，這提示發(fā)生精子趨化性的范圍可能很有限。雖然我們還不清楚體內(nèi)發(fā)生趨化性的確切部位，但是綜合各種因素分析，最有可能的有以下三處：①輸卵管峽部精子儲(chǔ)存區(qū)至輸卵管壺腹部受精位點(diǎn)之間；②輸卵管壺腹部的卵丘附近；③卵丘中。

精子在附睪緩慢移行過(guò)程中，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的膜修飾和結(jié)構(gòu)變化，獲得了功能上的成熟；但射出精子或從附睪尾部取出的精子并不能直接使卵子受精。現(xiàn)已證實(shí)，所有已研究的哺乳動(dòng)物精子都要經(jīng)歷獲能，才能完成受精。獲能是一多時(shí)相過(guò)程，有廣義、狹義之分。狹義的獲能指精子具有發(fā)生頂體反應(yīng)的能力，所以獲能是頂體反應(yīng)的前提和基礎(chǔ)；廣義的獲能則包括頂體反應(yīng)，即發(fā)生頂體反應(yīng)標(biāo)志著精子獲能完成。

獲能的本質(zhì)在于暴露精子膜表面卵識(shí)別、結(jié)合因子，解除對(duì)精子頂體反應(yīng)的抑制，并使精子得以識(shí)別卵子并穿入卵內(nèi)，完成受精。在生理?xiàng)l件下，不同種動(dòng)物，精子獲能的部位并不一樣，但多數(shù)動(dòng)物的精子獲能主要都發(fā)生在子宮和輸卵管內(nèi)。同時(shí)精子獲能所需要的時(shí)間也因種類不同而不同，人精子一般需要5～7小時(shí)。精子獲能還具有異質(zhì)性，同一群體的精子獲能有先有后，并不同時(shí)發(fā)生。

獲能精子在結(jié)構(gòu)和功能上都發(fā)生了一系列特異性變化，具體表現(xiàn)在精子超活化、精子代謝方式改變、精子膜變化和精子形態(tài)變化四個(gè)方面。

在哺乳動(dòng)物中，剛射出的精子不足以讓卵子受精，其受精能力需在去除抑制因子（如表面附著糖蛋白，精漿蛋白和膜膽固醇）后出現(xiàn)。在精子獲能的最后階段，精子運(yùn)動(dòng)方式不同于附睪成熟精子或射出精子，發(fā)生了顯著變化，表現(xiàn)為一種強(qiáng)有力的、尾部呈“鞭打樣”的不對(duì)稱運(yùn)動(dòng)，稱之為精子超活化，這種現(xiàn)象經(jīng)常在輸卵管中觀察到。CatSper通道和鈣是超活化的關(guān)鍵，外部鈣的缺乏或四個(gè)CatSper亞基中的任一個(gè)發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致超激活的失敗。但CatSper在輸卵管中的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。目前常用精子超活化（hyperactivation，HA）作為評(píng)價(jià)精子獲能與否的指標(biāo)。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，超活化精子以鞭毛彎曲幅度大為特征。計(jì)算機(jī)輔助精液分析（computer-aided-semen-analysis，CASA）技術(shù)可以從精子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力學(xué)本質(zhì)來(lái)研究和相對(duì)客觀地確定超活化精子。按照CASA精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)結(jié)果分析，精子超活化主要是以軌跡速度（curvilinear velocity，VCL）增加，直線性（linearity，LIN）、前向性（straightness，STR）降低和精子側(cè)擺幅度（amplitude of lateral head displacement，ALH）增加為特征。對(duì)于群體精子超活化可以以下列標(biāo)準(zhǔn)界定：VCL＞100μm／s、LIN≤65和ALH≥7.5。然而，因?yàn)槭褂玫膬x器不同，或者設(shè)置的分析參數(shù)不一樣，不同的實(shí)驗(yàn)室常會(huì)有不同的CASA界定標(biāo)準(zhǔn)，如Mortimer報(bào)道認(rèn)為，精子超活化標(biāo)準(zhǔn)為：VCL≥150μm／s、LIN≤50%、ALH≥7.0μm。所以，1998年人類生殖與胚胎協(xié)會(huì)男科學(xué)專門(mén)興趣小組（ESHRE Andrology Special Interest Group）提出必須開(kāi)發(fā)新的CASA方法，以糾正超活化精子動(dòng)力學(xué)分析的可能偏差。但至今尚未找到公認(rèn)的統(tǒng)一手段。

實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，在黏性低的介質(zhì)中，超活化精子雖然運(yùn)動(dòng)快速而強(qiáng)有力，但非前向性，故不如附睪成熟精子有效；而在黏性高和黏彈性基質(zhì)中，如聚丙烯酰胺中，超活化精子的運(yùn)動(dòng)則比附睪成熟精子更具直線化，更為有效。

對(duì)于精子超活化的生理意義，目前認(rèn)為可能有以下幾方面：①精子超活化增強(qiáng)了精子擺脫輸卵管黏膜上皮的能力，有利于精子通過(guò)輸卵管腔內(nèi)黏稠介質(zhì)，使精子能順利地沿輸卵管管腔繼續(xù)上行至受精處；②超活化精子強(qiáng)有力的鞭毛運(yùn)動(dòng)賦予了精子穿透放射冠和透明帶的力學(xué)基礎(chǔ)，使精子能順利穿越放射冠和透明帶的黏彈性基質(zhì)；③精子超活化的發(fā)生率與IVF呈高度正相關(guān)。

精子內(nèi)游離Ca ²⁺濃度升高可能是超活化發(fā)生的主要原因。其證據(jù)有：①超活化精子內(nèi)游離Ca ²⁺濃度顯著高于附睪成熟精子，并且游離Ca ²⁺主要集中于精子鞭毛。②頂體反應(yīng)后，精子內(nèi)游離Ca ²⁺濃度進(jìn)一步升高，超活化精子鞭毛彎曲幅度增大。

精子運(yùn)動(dòng)變化必然有相應(yīng)的精子代謝變化。精子獲能后的代謝變化主要表現(xiàn)在以下幾方面：

獲能前精子以糖酵解為主要能量來(lái)源，通過(guò)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）催化3-磷酸甘油醛生成含有高能磷酸基團(tuán)的1，3-二磷酸甘油酸，并在磷酸甘油醛激酶作用下將高能磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給ADP生成三磷腺苷（ATP）。獲能后精子運(yùn)動(dòng)加快、代謝增強(qiáng)、耗氧量明顯增加，無(wú)氧酵解途徑產(chǎn)生的ATP無(wú)法滿足精子對(duì)能量的需求，糖酵解和有氧氧化2種供能方式同時(shí)啟動(dòng)。作為運(yùn)動(dòng)器官的精子尾，其內(nèi)部線粒體可以氧化磷酸化方式合成大量ATP。ATP合酶位于線粒體內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)，公認(rèn)的化學(xué)滲透假說(shuō)認(rèn)為，底物脫下的氫經(jīng)呼吸鏈傳遞，最終與氧結(jié)合生成水所釋放的能量，在ATP合酶的催化作用下使ADP與pi發(fā)生磷酸化生成ATP。

伴隨著超激活運(yùn)動(dòng)的發(fā)生，獲能精子中很多相關(guān)酶類的活性也發(fā)生了巨大變化。隨著獲能進(jìn)程，精子腺苷酸環(huán)化酶（AC）、頂體酶和神經(jīng)氨酸苷酶等相繼被激活。膽固醇流失引起的Ca ²⁺、HCO ₃ ^-內(nèi)流激活了AC，伴隨著細(xì)胞外Ca ²⁺、HCO ₃ ^-內(nèi)流，胞質(zhì)內(nèi)Ca ²⁺也在向線粒體加速內(nèi)流，最終胞質(zhì)內(nèi)Ca ²⁺緩慢降低，頂體酶原逐漸活化為頂體酶，激活的頂體酶作用于膜上和膜內(nèi)相關(guān)成分，觸發(fā)了后續(xù)的一系列獲能相關(guān)反應(yīng)。其中，酸性磷酸酶（ACP）是精子獲能過(guò)程中變化最為劇烈的頂體酶類之一，磷酸酶的激活提高了膜脂代謝率，產(chǎn)生大量溶血磷脂，這些溶血磷脂代謝產(chǎn)生的甘油二酯可激活蛋白激酶，通過(guò)調(diào)控PTP影響精子獲能。S.Mack等的體外獲能研究表明，獲能后4小時(shí)，ACP活性比獲能前降低了2倍，但其他頂體酶類活性并無(wú)明顯變化。然而獲能后ACP活性降低的原理并不清楚。也有研究證明，獲能過(guò)程中神經(jīng)氨酸苷酶也被激活，而抑制獲能的磷酸二酯酶的活性則被抑制，導(dǎo)致胞內(nèi)cAMP含量升高，觸發(fā)了精子細(xì)胞內(nèi)獲能相關(guān)蛋白的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)了精子獲能。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs-mu）家族對(duì)獲能的影響正在成為近幾年研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，冷凍導(dǎo)致假獲能精子增多，同時(shí)GSTs-mu5表達(dá)增強(qiáng)，而同類研究表明，GSTs-mu5促進(jìn)了小鼠和倉(cāng)鼠精子的酪氨酸磷酸化，GSTs家族另一成員GSTs-mu3促進(jìn)了牛、羊精子獲能過(guò)程相關(guān)蛋白的酪氨酸磷酸化，同時(shí)，該研究推測(cè)，GSTs-mu3的磷酸化對(duì)平衡獲能過(guò)程中精子代謝產(chǎn)生的活性氧有重要作用。

精子獲能是精子在分子水平上的重建。獲能精子膜在分子水平上發(fā)生了一系列有規(guī)律的顯著性改變，精子膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了重組，包括膜蛋白、糖基和膜脂成分的改變，膜流動(dòng)性變化等。

在射精的過(guò)程中，附睪內(nèi)的精子與男性附屬性腺分泌物混合，附屬性腺分泌的蛋白質(zhì)會(huì)以多種方式影響精子，其中一種方式是一些蛋白質(zhì)與精子膜上的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)相互作用以抑制精子過(guò)早的獲能。例如，精子囊泡分泌2（SVS2）在小鼠精子的后體區(qū)域與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合，以抑制體外附睪精子的鈣化；小鼠精囊的絲氨酸蛋白酶抑制劑kazal型樣蛋白（SPINKL）在體外有延遲附睪小鼠精子獲能的能力等。另一些掩蓋精卵識(shí)別位點(diǎn)的蛋白質(zhì)也將被丟失，而一些與精卵識(shí)別有關(guān)的蛋白質(zhì)或者被暴露或者被重新分布。如精子膜蛋白PH-20，頂體反應(yīng)之前主要位于頂體后區(qū)質(zhì)膜；頂體反應(yīng)后在Ca ²⁺存在的條件下，PH-20簇集于頂體內(nèi)膜。PH-20的這種主動(dòng)位移現(xiàn)象與其在精卵識(shí)別中發(fā)揮的作用相一致。而大鼠精子在附睪成熟過(guò)程中，精子膜主要是頂體前區(qū)，結(jié)合有附睪上皮細(xì)胞分泌的37kDa糖蛋白D／E；獲能后，D／E則逐漸移向赤道部和頂體后區(qū)。

獲能過(guò)程中，精子膜凝集素受體，尤其是在精子頂體區(qū)，發(fā)生了顯著變化。實(shí)驗(yàn)表明，倉(cāng)鼠精子獲能過(guò)程中伴刀豆素蛋白A（ConA）受體和LCA受體數(shù)量經(jīng)歷了由多至少，再由少至多的復(fù)雜變化；而PNA受體和麥芽凝集素（WGA）受體逐漸減少；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，ConA受體由獲能前的均勻分布轉(zhuǎn)變至獲能后的成簇分布。豚鼠精子獲能后SBA受體增加，采用FITC耦聯(lián)的甘露糖化牛血清白蛋白（FITC-M-BSA）為探針，研究人精子頭部質(zhì)膜在獲能前后甘露糖結(jié)合活性的變化，結(jié)果表明，獲能精子頭部與頂體區(qū)或頂體后區(qū)表達(dá)有甘露糖受體活性，而且其活性與精子受精能力高度相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，人精子獲能前在頂體后區(qū)沒(méi)有SBA受體，獲能后出現(xiàn)了SBA受體；人精子膜WGA受體在獲能后也有顯著增加，并轉(zhuǎn)移至精子頂體后區(qū)。獲能時(shí)精子膜凝集素受體重排，可能為精卵結(jié)合創(chuàng)造了條件。

獲能后的精子膜流動(dòng)性有了顯著增加，主要是由于獲能精子膽固醇成分大量丟失和磷脂代謝活化；此外，獲能時(shí)能量代謝和脂類代謝活化，會(huì)生成大量自由基，適量的自由基也能改變精子膜流動(dòng)性。

獲能精子膜流動(dòng)性升高有利于精卵結(jié)合，這表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：①獲能精子膜流動(dòng)性有區(qū)域性差異，其中以頂體后區(qū)膜流動(dòng)性最大，而該區(qū)域被認(rèn)為是精卵膜結(jié)合和融合區(qū)。②精子膜出現(xiàn)高度特異性區(qū)域，簇集了一些可能與受精相關(guān)的功能蛋白質(zhì)和糖基。

獲能精子膜的分子結(jié)構(gòu)也有所改變，表現(xiàn)為精子表面游離的活性基團(tuán)減少，如—SH進(jìn)一步氧化為二硫鍵，唾液酸殘基被清除，精子膜表面負(fù)電荷明顯減少，精子電泳遷移率降低等。

精子獲能過(guò)程中，膜蛋白、膜凝集素受體分布的有序重建、重排，可能是由于以下原因所致：①精子膜流動(dòng)性增加，能使糖蛋白易于運(yùn)動(dòng)。②蛋白酶、糖苷酶活化使精子膜蛋白降解、丟失。③糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶的作用，使凝集素結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)移或丟失。④糖蛋白、糖脂分子的立體構(gòu)型變化，使原有的糖基暴露或被遮蓋，導(dǎo)致凝集素受體位點(diǎn)變化。

綜上所述，精子膜在獲能過(guò)程中產(chǎn)生了深刻變化，這些變化有重要的生理意義：①去除精子膜表面遮蓋物，暴露精卵識(shí)別位點(diǎn)。②膜通透性變化，有利于Ca ²⁺內(nèi)流，增強(qiáng)精子活力。③降低膜流動(dòng)性，富集功能蛋白質(zhì)或糖基，形成高度特異性區(qū)域，有利于頂體反應(yīng)和受精。

精子獲能以后，其質(zhì)膜和生化方面發(fā)生了一系列顯著變化，這已廣為人們所認(rèn)識(shí)。但與之相比較，長(zhǎng)期以來(lái)的光鏡和電鏡研究都認(rèn)為，在獲能過(guò)程中，精子形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。然而最近Thomas等人應(yīng)用X線顯微鏡技術(shù)研究了人射出精子和獲能精子的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)獲能后的精子線粒體或是松散地包繞軸絲，或是發(fā)生腫脹，這明顯不同于射出精子。體細(xì)胞研究證實(shí)，細(xì)胞代謝狀態(tài)變化常常伴隨有線粒體大小和形態(tài)改變；Cardull等人也注意到精子鞭毛擺動(dòng)頻率增加，其線粒體體積會(huì)增大。這提示線粒體形態(tài)改變是精子獲能過(guò)程的一個(gè)重要方面，它可能參與了精子超活化運(yùn)動(dòng)的發(fā)育。

見(jiàn)本章第三節(jié)二、三部分。

精子發(fā)生頂體反應(yīng)時(shí)，頂體外膜及其表面精子膜發(fā)生多點(diǎn)融合，融合處形成許多膜被囊泡；隨之頂體破裂，頂體內(nèi)容物釋放，頂體內(nèi)膜完全暴露。由此可見(jiàn)，頂體反應(yīng)是一種特殊的細(xì)胞胞吐（圖9-2）。

頂體形成是一系列高度有序的整合過(guò)程，一般將頂體的演變分為4個(gè)獨(dú)立的時(shí)期：第一時(shí)期為高爾基復(fù)合體階段，許多來(lái)源于反式高爾基復(fù)合體網(wǎng)絡(luò)的前高爾基復(fù)合體顆粒在髓質(zhì)區(qū)聚集，小的顆粒互相融合形成了一個(gè)大的高爾基復(fù)合體顆粒，并且與核包膜緊密相連。第二時(shí)期為頂帽階段，新合成的來(lái)源于高爾基復(fù)合體的糖蛋白不斷擴(kuò)大形成球形的頂體顆粒。第三時(shí)期為頂體階段，高密度的頂體顆粒在頂體內(nèi)膜演變，最后變成了半球形，頂體囊泡覆蓋精子細(xì)胞核的大部分表面形成頂體，這個(gè)結(jié)構(gòu)一直持續(xù)到最后一個(gè)階段。第四時(shí)期即為成熟階段，表明了頂體的正確形成。頂體是精子頭部的重要組成部分，頂體形成的每一步都是嚴(yán)格有序的，受多種基因調(diào)控，頂體發(fā)生過(guò)程異常會(huì)影響男性的生育能力。

頂體內(nèi)容物為多種酶組成的頂體酶復(fù)合系統(tǒng)，包括與受精有關(guān)的主要酶：透明質(zhì)酸酶、頂體素、放射冠分散酶、精子神經(jīng)酰胺酶和酸性磷酸酶。其中以頂體素研究較為透徹、深入。

頂體素（又稱為頂體蛋白酶）是一類絲氨酸蛋白水解酶，人的頂體素分子量約為40kDa。頂體素分子中共有12個(gè)Cys殘基，分別形成兩個(gè)鏈間二硫鍵和四個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，故頂體素是由二硫鍵連接的雙鏈分子。His70、Asp124、Ser222等殘基構(gòu)成了頂體素的催化活性位點(diǎn)。在所有已知的頂體素分子中，Cys殘基的位置和數(shù)量以及頂體素的催化活性位點(diǎn)序列基本相同，在進(jìn)化上高度保守。此外，頂體素重鏈N端含有與透明帶結(jié)合的位點(diǎn)。在兔中，該位點(diǎn)是一個(gè)包括Arg50、Arg51殘基在內(nèi)的由Ile43殘基至His53殘基組成的環(huán)。若將Arg50、Arg51殘基定點(diǎn)突變，則頂體素失去結(jié)合透明帶的能力。頂體素重鏈C端有一富含Pro殘基的肽段，這不同于其他類型的絲氨酸蛋白水解酶。

頂體素基因是一斷裂基因。人的頂體素基因位于22q13-22qter區(qū)域，共有五個(gè)外顯子，為4個(gè)大小約0.2kDa至4.5kDa的內(nèi)涵子所分隔。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于ATG上游74bp處；啟動(dòng)子富含GC，缺乏TATA盒和CAAT結(jié)構(gòu)。催化位點(diǎn)中的His、Asp、Ser等三個(gè)氨基酸殘基分別由不同的外顯子編碼。此外，編碼C端富含Pro殘基序列的外顯子有獨(dú)特的CCCCCA重復(fù)序列。

精子發(fā)生是一高度復(fù)雜的生理過(guò)程。基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有高度的時(shí)空特異性，包括不同的功能基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)于精子發(fā)生的不同發(fā)育階段，以及同一基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)分別發(fā)生于精子發(fā)生的不同發(fā)育階段。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠、小鼠的頂體素基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生于減數(shù)分裂前的精母細(xì)胞，頂體素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)位于5′端；而頂體素基因的翻譯則開(kāi)始于減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞；整個(gè)翻譯過(guò)程是由一種未知的胞質(zhì)蛋白結(jié)合于mRNA的5′端而進(jìn)行調(diào)控。

頂體素基因表達(dá)的初始產(chǎn)物為前頂體素原（preproacrosin）。前頂體素原經(jīng)翻譯后加工切去信號(hào)肽，成為前頂體素，也稱頂體素酶原。和前頂體素原一樣，前頂體素也是一單鏈分子。人的前頂體素原含有421個(gè)氨基酸殘基，前頂體素共有402個(gè)氨基酸殘基，分子量為43.9kDa。頂體素通常以無(wú)活性酶原形式即前頂體素結(jié)合于頂體內(nèi)膜上，在精子結(jié)合于透明帶后活化為頂體素。也有一種觀點(diǎn)認(rèn)為獲能也能使前頂體素激活，并轉(zhuǎn)移至精子膜表面。頂體素可使透明帶分解，以利于精子穿透透明帶。宮頸黏液中的蛋白酶抑制劑和抗凝血酶可抑制頂體素酶解活性，抑制精子穿透透明帶。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胰蛋白酶抑制劑和頂體素單克隆抗體能直接抑制受精作用。然而，近期也有報(bào)道，頂體素基因敲除的小鼠，其精子仍能穿透透明帶，這表明可能存在其他因子降解透明帶或存在其他因素使精子能順利穿透透明帶。

研究者按頂體反應(yīng)啟動(dòng)的刺激因素性質(zhì)，將頂體反應(yīng)分為自發(fā)性頂體反應(yīng)（spontaneous acrosome reaction，SAR）和誘導(dǎo)性頂體反應(yīng)（induced acrosome reaction，IAR）。自發(fā)性頂體反應(yīng)是指精子在獲能后，未與卵子接觸就已自發(fā)性發(fā)生了頂體反應(yīng)；誘發(fā)性頂體反應(yīng)是指精子在獲能后，與卵相互作用在透明帶誘導(dǎo)下，或在體外由誘導(dǎo)劑作用，誘發(fā)頂體反應(yīng)。

大量研究表明，只有頂體完整的精子才能識(shí)別、結(jié)合并穿透透明帶；在接觸透明帶之前已發(fā)生了頂體反應(yīng)的精子，不能識(shí)別、結(jié)合透明帶，從而失去受精能力。一份精液中的精子處于不同的成熟狀態(tài)，或者有一些精子存在結(jié)構(gòu)和功能上的缺陷，使同份精液內(nèi)的精子不會(huì)全部呈現(xiàn)同一時(shí)間的獲能與頂體反應(yīng)。顯示高水平自發(fā)性頂體反應(yīng)的精液可能受精能力低。但適量的自發(fā)性反應(yīng)對(duì)受精是有意義的，也是必需的。自發(fā)性頂體反應(yīng)精子釋放的頂體酶系可分散放射冠，為頂體完整的精子順利通過(guò)放射冠與透明帶相接觸創(chuàng)造了一定條件。

精子獲能及適時(shí)有效的頂體反應(yīng)是成功受精的前提。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)獲能和頂體反應(yīng)從現(xiàn)象到機(jī)制進(jìn)行了多年的大量研究，積累了許多有價(jià)值的資料，但其機(jī)制至今仍未完全闡明。目前多數(shù)研究者認(rèn)為，作為一種細(xì)胞生理活動(dòng)，獲能和頂體反應(yīng)也一樣是由于精子外刺激因子作用于精子膜，經(jīng)膜信號(hào)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)，觸發(fā)一系列精子內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。

在生理?xiàng)l件下，獲能和頂體反應(yīng)均發(fā)生于雌性生殖管道。雌性生殖管道內(nèi)的許多成分，如子宮液、輸卵管液、卵泡液、放射冠液和透明帶，都能促進(jìn)獲能或誘導(dǎo)頂體反應(yīng)。但由于體內(nèi)研究較為困難，有關(guān)資料多由射出精子在體外培養(yǎng)時(shí)獲得。

許多離子如Ca ²⁺、Na ⁺、K ⁺和Zn ²⁺對(duì)精子獲能和頂體反應(yīng)都有重要影響。

Ca ²⁺是細(xì)胞第二信使，細(xì)胞內(nèi)游離Ca ²⁺濃度（［Ca ²⁺］i）的改變是細(xì)胞內(nèi)生理功能實(shí)現(xiàn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是多種受體激活后信號(hào)傳遞過(guò)程的中心環(huán)節(jié)。早期應(yīng)用熒光探針?lè)椒ㄒ延^察到，在精子獲能和頂體反應(yīng)過(guò)程中，精子［Ca ²⁺］i發(fā)生了顯著變化。此后的大量研究進(jìn)一步證實(shí)，精子獲能與頂體反應(yīng)有賴于精子內(nèi)［Ca ²⁺］i升高，維持精子內(nèi)一定水平的［Ca ²⁺］i是獲能和頂體反應(yīng)的關(guān)鍵。

目前，已知許多促進(jìn)獲能和誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的介質(zhì)都是通過(guò)刺激細(xì)胞外Ca ²⁺大量?jī)?nèi)流，使精子［Ca ²⁺］i升高而得以實(shí)現(xiàn)的，如肝素、透明帶和黃體酮。但也有人認(rèn)為精子獲能時(shí)胞內(nèi)游離Ca ²⁺濃度并未發(fā)生變化。

Na ⁺是不可缺少的。在高Na ⁺溶液中，獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)的精子數(shù)量及速度都大幅度增加，而以Na ⁺載體monension和精子共孵育，可迅速升高精子內(nèi)Na ⁺濃度，也加速精子頂體反應(yīng)的發(fā)生。Na ⁺促進(jìn)獲能和頂體反應(yīng)的作用和機(jī)制可能是：①精子內(nèi)Na ⁺水平升高造成精子內(nèi)pH升高，升高的精子內(nèi)pH可促進(jìn)精子內(nèi)鈣池釋放Ca ²⁺，使［Ca ²⁺］i上升。②增加Na ⁺量會(huì)使溶液的離子強(qiáng)度升高，促進(jìn)了精子膜去能因子的丟失，加速精子獲能和頂體反應(yīng)。

K ⁺在精子獲能和頂體反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。但是K ⁺是作用于獲能和／或頂體反應(yīng)尚不能肯定，而且K ⁺的作用具有種屬特異性。如大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、人等精子獲能和頂體反應(yīng)依賴于K ⁺的存在，而豚鼠精子獲能和頂體反應(yīng)不需要K ⁺。K ⁺促進(jìn)獲能和誘導(dǎo)頂體反應(yīng)可能是由于胞外K ⁺激活了精子質(zhì)膜上的Na ⁺，K ⁺-ATP酶，促進(jìn)K ⁺內(nèi)流，導(dǎo)致精子膜去極化，從而激活精子膜上的電壓依賴性Ca ²⁺通道。Na ⁺，K ⁺-ATP酶抑制劑ouabin可阻止倉(cāng)鼠精子頂體反應(yīng)的發(fā)生，而Na ⁺，K ⁺-ATP酶激活劑nigericin則能促進(jìn)K ⁺內(nèi)流，加速精子發(fā)生頂體反應(yīng)。

細(xì)胞內(nèi)pH也是影響細(xì)胞生理活動(dòng)的重要因素。許多介質(zhì)在誘導(dǎo)獲能和頂體反應(yīng)中，不但有［Ca ²⁺］i升高，而且也有精子內(nèi)pH上升。合適的精子內(nèi)pH對(duì)精子獲能和頂體反應(yīng)的作用可能與［Ca ²⁺］i一樣重要。影響精子內(nèi)pH的因素有很多，如HCO ₃ ^-、Cl ^-、H ⁺、Na ⁺等。HCO ₃ ^-除對(duì)精子內(nèi)pH有影響外，還能激活腺苷酸環(huán)化酶，使精子內(nèi)cAMP水平升高。

此外，Zn ²⁺能通過(guò)穩(wěn)定精子膜或直接抑制頂體素活性而抑制精子獲能。

白蛋白能促進(jìn)、支持精子獲能和頂體反應(yīng)。所以，多年來(lái)白蛋白作為獲能不可缺少的物質(zhì)常規(guī)應(yīng)用于精子獲能研究的體外模型中。多數(shù)人認(rèn)為白蛋白可能是通過(guò)吸附、去除精子質(zhì)膜的膽固醇，降低膜流動(dòng)性，從而發(fā)揮其作用。但也有一種觀點(diǎn)認(rèn)為并不是白蛋白去除了精子質(zhì)膜的膽固醇，而是轉(zhuǎn)脂蛋白將精子質(zhì)膜的膽固醇轉(zhuǎn)移至白蛋白，白蛋白是作為膽固醇受體的角色在起作用。

輸卵管液、卵泡液是誘導(dǎo)精子獲能的重要環(huán)境因素，近期有許多資料表明，黃體酮是輸卵管液，卵泡液中誘導(dǎo)精子獲能的最主要成分，也可能是體內(nèi)精子頂體反應(yīng)尤其是自發(fā)性頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)劑。黃體酮主要由卵丘細(xì)胞產(chǎn)生，在人卵泡液中黃體酮濃度高達(dá)5μmol／L，與體外研究時(shí)使用的黃體酮濃度相近。黃體酮誘導(dǎo)精子獲能的機(jī)制還未能最后闡明，但精子結(jié)構(gòu)的特殊性以及大量實(shí)驗(yàn)提示，黃體酮誘導(dǎo)精子獲能不可能通過(guò)新蛋白質(zhì)合成即經(jīng)典的基因組作用而只能通過(guò)與膜有關(guān)的即非基因組作用機(jī)制介導(dǎo)。因此，在精子膜上可能存在黃體酮受體。目前，支持精子膜上存在黃體酮受體的主要證據(jù)有：①黃體酮可促進(jìn)精子外Ca ²⁺快速內(nèi)流，使精子內(nèi)游離Ca ²⁺濃度（［Ca ²⁺］i）立即升高。黃體酮的這一作用有明顯劑量依賴性，最小效應(yīng)的黃體酮?jiǎng)┝吭?0 ^-9～10 ^-8mol范圍內(nèi)，最大劑量在10 ^-6～10 ^-5mol范圍內(nèi)。②獲能精子具有特殊的超活化運(yùn)動(dòng)方式。以超活化運(yùn)動(dòng)為指標(biāo)，觀察黃體酮及其核內(nèi)受體特異性阻滯劑RU486、ZK98299對(duì)精子獲能的影響，發(fā)現(xiàn)黃體酮能以劑量依賴性方式快速誘導(dǎo)精子HA，但RU486、ZK98299都不能阻斷其效應(yīng)。同時(shí)，人工合成的黃體酮類似物能作用于核內(nèi)黃體酮受體，但不能模擬黃體酮對(duì)精子的效應(yīng)，這表明，黃體酮不是通過(guò)核內(nèi)受體，而是直接作用于精子膜激發(fā)精子獲能。③耦聯(lián)BSA的黃體酮不能通透細(xì)胞膜進(jìn)入精子內(nèi)，但仍能快速促進(jìn)精子［Ca ²⁺］i升高，誘導(dǎo)精子獲能和頂體反應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，耦聯(lián)BSA的黃體酮能緊密地結(jié)合于精子膜上，并主要集中在精子頭部頂體區(qū)。④應(yīng)用人工合成的 ¹²⁵I黃體酮受體配基標(biāo)記精子質(zhì)膜，發(fā)現(xiàn)精子質(zhì)膜有兩種黃體酮結(jié)合位點(diǎn)，鑒定出純化后的膜結(jié)合位點(diǎn)分子量分別為54kDa和57kDa。其中，P54位點(diǎn)和黃體酮親和力高，平衡解離常數(shù)（K _D）為nM水平，表明為黃體酮高度特異；P57位點(diǎn)親和力較前者低，Kd為μM水平，11羥-黃體酮和17α-羥黃體酮與其親和力基本一致，表明其特異性不高。Western印跡分析顯示，黃體酮核受體的黃體酮結(jié)合區(qū)C262單克隆抗體能識(shí)別P54、P57，而DNA結(jié)合區(qū)及N末端的單克隆抗體則不能識(shí)別P54、P57；在精子胞質(zhì)中也無(wú)P54、P57。并且C262單克隆抗體能抑制黃體酮誘導(dǎo)的精子獲能和頂體反應(yīng)，表明精子膜黃體酮受體或結(jié)合位點(diǎn)和核內(nèi)黃體酮受體有共同的黃體酮結(jié)合區(qū)，但無(wú)核內(nèi)受體的DNA結(jié)合區(qū)等。

然而，有關(guān)精子膜黃體酮受體的研究常常有相互矛盾的結(jié)果，如：早期文獻(xiàn)報(bào)道，黃體酮能誘導(dǎo)正常男子10%的射出精子發(fā)生頂體反應(yīng)，這些精子膜都有黃體酮結(jié)合位點(diǎn)；另一些實(shí)驗(yàn)又稱，正常男子射出精子的大部分膜上無(wú)黃體酮受體活性；而近期文獻(xiàn)報(bào)道，黃體酮能誘導(dǎo)90%射出精子［Ca ²⁺］i升高，明顯高于前期報(bào)道等。射出精子對(duì)黃體酮不同的反應(yīng)性以及精子膜黃體酮受體實(shí)驗(yàn)結(jié)果的多樣性提示，精子膜可能存在不同類型的黃體酮受體。總結(jié)已有的資料，推測(cè)精子膜至少存在三種不同類型的黃體酮受體。①Ⅰ型黃體酮受體（PR1）：PR1可能與精子膜Ca ²⁺通道為同一復(fù)合物；該受體和精子［Ca ²⁺］i快速升高密切相關(guān)，90%以上的射出精子該受體具有活性。②Ⅱ型黃體酮受體（PR2）：為酪氨酸蛋白激酶（PTK）型受體，該受體激活后，精子對(duì)生理濃度的黃體酮敏感性將有較大提高。黃體酮誘導(dǎo)的精子頂體反應(yīng)可能與其有關(guān)。③Ⅲ型黃體酮受體（PR3）：耦聯(lián)Cl ^-通道，類似于GABAA受體／Cl ^-通道、甘氨酸受體／Cl ^-通道，主要誘導(dǎo)頂體反應(yīng)過(guò)程中Cl ^-外流，也可引起Ca ²⁺進(jìn)一步內(nèi)流。因此，黃體酮作用于精子可能由多受體系統(tǒng)介導(dǎo)，其中，某一受體異常就有可能導(dǎo)致精子正常功能喪失。黃體酮誘導(dǎo)獲能和頂體反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制見(jiàn)本節(jié)后續(xù)部分。

對(duì)兔精子的一系列獲能實(shí)驗(yàn)顯示，注射外源雌激素對(duì)體內(nèi)獲能似乎不起任何作用，黃體酮?jiǎng)t明顯抑制獲能。然而哺乳動(dòng)物排卵前所處的發(fā)情期E水平呈明顯高峰，雌性動(dòng)物體內(nèi)的高E水平對(duì)其生殖道內(nèi)的精子獲能不起作用令人費(fèi)解。Bathla等將倉(cāng)鼠附睪尾精子放在發(fā)情期（雌激素占優(yōu)勢(shì)）和發(fā)情間期（黃體酮占優(yōu)勢(shì)）的子宮中，結(jié)果在外源雌激素存在的情況下，不管處什么時(shí)期的子宮都能使精子獲能，頂體反應(yīng)也明顯高于對(duì)照。外源E可能促進(jìn)了與獲能和頂體反應(yīng)有關(guān)的子宮蛋白的合成。因此雌激素對(duì)獲能的作用及機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

PRL在雌性生殖道和精漿中都能被檢測(cè)到，它在精子獲能中的作用一直存在爭(zhēng)議。有報(bào)道稱PRL在人精子獲能及頂體反應(yīng)中都不起重要作用。同時(shí)也有相反觀點(diǎn)，如Fukuda等發(fā)現(xiàn)PRL能將小鼠精子活力很好地保持2小時(shí)，獲能液中加50ng／ml或100ng／ml PRL孵育15或30分鐘，IVF時(shí)能獲得更高的受精率。因此推測(cè)PRL的生理作用是縮短最佳預(yù)孵期即獲能時(shí)間，并維持精子運(yùn)動(dòng)和活力。

PRL出現(xiàn)在精液中可起到調(diào)節(jié)雄性生殖能力的作用。有人認(rèn)為PRL通過(guò)控制睪丸和附性器官中的激素受體水平以及促進(jìn)與獲能有關(guān)的精子生化過(guò)程來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)目的。出現(xiàn)完全不同結(jié)果的原因可能與精子來(lái)源（附睪尾或射出精子）及其本身PRL含量有關(guān)。

目前有一點(diǎn)是清楚的，精漿中過(guò)高的PRL水平對(duì)精子功能有負(fù)面影響。因?yàn)闄z測(cè)男性不育者精液，發(fā)現(xiàn)那些精子密度低、活力差或人精子去透明帶倉(cāng)鼠卵穿透試驗(yàn)不正常的個(gè)體精液中PRL水平都明顯增高。

PGs在動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布，在精液中PGs的濃度較高。PGs對(duì)精子獲能及受精的作用研究較少。有人研究了PGE ₁對(duì)小鼠和人精子獲能的影響，發(fā)現(xiàn)PGE ₁對(duì)小鼠體外獲能具促進(jìn)作用，起到“獲能因子”的作用，而且不會(huì)引發(fā)頂體反應(yīng)，但可加強(qiáng)由Ca ²⁺載體或透明帶誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)。PGE ₁對(duì)人精子的作用似乎僅是加強(qiáng)由Ca ²⁺載體誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)，對(duì)人卵泡液介導(dǎo)的頂體反應(yīng)也沒(méi)有增強(qiáng)作用。后續(xù)有人證實(shí)了PGE ₁和PGE ₂在精子膜上具有與黃體酮受體不同的共同受體，兩者都能促進(jìn)Ca ²⁺內(nèi)流，增強(qiáng)頂體反應(yīng)。

活性氧是精子氧化反應(yīng)的副產(chǎn)物，在正常情況下，可由抗氧化酶直接清除，當(dāng)ROS水平超過(guò)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶清除能力時(shí)，ROS就會(huì)腐蝕精子膜表面的多元不飽和脂肪酸，對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用。當(dāng)精液中死精子增加時(shí)，過(guò)量的ROS和精液中的白蛋白可誘發(fā)精子質(zhì)膜發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，降低膜流動(dòng)性，不利于精子獲能，并使精子活動(dòng)能力降低甚至喪失，抑制受精過(guò)程。但是，阻斷ROS生成后，人精子無(wú)法實(shí)現(xiàn)獲能，說(shuō)明ROS是獲能所必需的。在獲能初期O ₂ ^-較高，之后緩慢降低至較低水平，甚至比未獲能精子水平還低。在獲能后45分鐘出現(xiàn)的ROS波峰正好對(duì)應(yīng)精子頭部和尾部發(fā)生蛋白酪氨酸磷酸化（PTP）的時(shí)間，說(shuō)明ROS與PTP密切關(guān)聯(lián)。低水平的O ₂ ^-、H ₂O ₂、NO等ROS可作為第二信使激活A(yù)C促進(jìn)cAMP的生成，導(dǎo)致PTP促進(jìn)獲能。

ROS對(duì)誘發(fā)精子獲能是必需的，精子獲能與ROS劑量有關(guān)，并且隨著獲能進(jìn)程，ROS的劑量呈現(xiàn)一定的動(dòng)態(tài)變化，所以ROS在體外獲能技術(shù)研究中非常重要，然而，誘發(fā)獲能的最佳劑量以及隨獲能進(jìn)程ROS的變化尚不很清楚，這將是本領(lǐng)域有待于深入研究與揭示的內(nèi)容之一。

體外觀察還顯示，血小板激活因子PAF及其代謝產(chǎn)物溶血性PAF、透明質(zhì)酸、肝素、肽類生長(zhǎng)因子等對(duì)精子獲能和頂體反應(yīng)都有促進(jìn)作用。

雌性生殖管道是精子體內(nèi)獲能和頂體反應(yīng)的場(chǎng)所。在雌性生殖管道中，有許多生物活性物質(zhì)包括上述的離子成分、蛋白質(zhì)、激素都對(duì)精子獲能和頂體反應(yīng)有重要作用。

以上游法篩選人運(yùn)動(dòng)精子，再使其穿越宮頸液，發(fā)現(xiàn)穿越宮頸黏液的精子，經(jīng)透明帶誘導(dǎo)后頂體反應(yīng)率顯著高于未穿越宮頸黏液的運(yùn)動(dòng)精子，但二者自發(fā)性頂體反應(yīng)率無(wú)顯著性差異。這表明宮頸液能促進(jìn)精子獲能但不誘發(fā)頂體反應(yīng)。宮頸黏液中的Ca ²⁺、葡萄糖、游離脂肪酸、磷脂在營(yíng)養(yǎng)精子的同時(shí)，也可能與其獲能有關(guān)。

子宮腔液內(nèi)的蛋白質(zhì)（主要是白蛋白和γ-球蛋白）、磷脂，可與精子表面的膽固醇結(jié)合，這種結(jié)合可促進(jìn)獲能；而子宮腔液內(nèi)的黃體酮可抑制這種作用。

輸卵管液和卵泡液：很早人們就發(fā)現(xiàn)輸卵管液和卵泡液能促進(jìn)精子獲能并誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，這與它們的離子成分及其內(nèi)含的黃體酮、白蛋白、轉(zhuǎn)脂蛋白、前列腺素、肝素、透明質(zhì)酸等有關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)，輸卵管上皮細(xì)胞主要是無(wú)纖毛細(xì)胞能分泌一種組織特異性強(qiáng)、分子量高的輸卵管糖蛋白（oviductal glycoprotein，OGP）。研究證實(shí)，OGP與公牛精子或豚鼠精子共同孵育，能使公牛精子或豚鼠精子獲能率提高近3倍，并顯著增加獲能精子穿卵率。

人類成熟卵細(xì)胞透明帶是環(huán)繞卵母細(xì)胞外層，厚約15～20μm的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此環(huán)狀結(jié)構(gòu)是由顆粒細(xì)胞分泌的ZP1、ZP2、ZP3、ZP4糖蛋白組成的。通過(guò)對(duì)透明帶糖蛋白的分離、純化發(fā)現(xiàn)，只有ZP1、ZP3、ZP4參與誘導(dǎo)產(chǎn)生頂體反應(yīng)，且ZP3為誘導(dǎo)頂體反應(yīng)最主要的成分。其中，ZP3主要通過(guò)激活Gi蛋白耦聯(lián)通路增加質(zhì)膜內(nèi)Ca ²⁺濃度（以蛋白水解酶處理ZP3，不影響ZP3結(jié)合精子膜能力，但抑制了ZP3誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)的能力，這說(shuō)明ZP3結(jié)構(gòu)的完整性是其誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)的基本條件）；ZP1、ZP4主要通過(guò)激活T型、L型Ca ²⁺通道增加質(zhì)膜內(nèi)Ca ²⁺濃度；ZP2主要與已發(fā)生過(guò)頂體反應(yīng)的精子結(jié)合，可能作為第二受體參與頂體反應(yīng)下游信號(hào)的激活。

質(zhì)譜分析透明帶成分發(fā)現(xiàn)：高度糖基化的透明帶糖蛋白及由N、O連接的聚糖鏈?zhǔn)菂⑴c誘發(fā)精子頂體反應(yīng)的主要分子結(jié)構(gòu)，尤其在ZP1、ZP3、ZP4中，由N連接的糖鏈在透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)過(guò)程中起重要作用。糖鏈之所以在透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)中具有重要作用，歸因于糖鏈?zhǔn)菂⑴c精子質(zhì)膜與透明帶識(shí)別、結(jié)合的位點(diǎn)。Pang等發(fā)現(xiàn)透明帶上的SLeX［NeuAcα2-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc］糖鏈及相關(guān)抗體結(jié)合抑制精卵結(jié)合的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

精子與透明帶結(jié)合，誘發(fā)產(chǎn)生頂體反應(yīng)的能力可以預(yù)測(cè)精子受精能力。由于人卵稀缺，透明帶來(lái)源局限，有學(xué)者通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)體外誘導(dǎo)合成重組人卵細(xì)胞透明帶（rhZP），并用rhZP在體外與精子結(jié)合，誘發(fā)頂體反應(yīng)，借此評(píng)估精子功能并預(yù)測(cè)受精情況。但是，體外rhZP誘發(fā)精子頂體反應(yīng)并不成功。原因可能是：首先，透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)具有種屬特異性，即人類的卵細(xì)胞透明帶只能與人類精子結(jié)合并誘發(fā)頂體反應(yīng)；其次，學(xué)者認(rèn)為透明帶糖蛋白糖基化的多樣性、復(fù)雜性是導(dǎo)致rhZP誘導(dǎo)頂體反應(yīng)失敗的主要原因。該觀點(diǎn)側(cè)面證實(shí)了糖蛋白在精卵識(shí)別中的重要作用。

前已述及，影響精子獲能和頂體反應(yīng)的因素有多種，大量研究資料表明，體內(nèi)誘導(dǎo)精子獲能的最重要物質(zhì)可能是黃體酮；在接觸透明帶前，啟動(dòng)精子與頂體反應(yīng)的也是黃體酮，而在頂體完整的獲能精子結(jié)合透明帶后，啟動(dòng)其頂體反應(yīng)的則是透明帶蛋白（ZP3）。以下我們以黃體酮誘導(dǎo)精子獲能、頂體反應(yīng)以及ZP3誘導(dǎo)頂體反應(yīng)為例闡述獲能和頂體反應(yīng)的機(jī)制。

在調(diào)節(jié)精子生理活動(dòng)包括獲能和頂體反應(yīng)過(guò)程中，精子［Ca ²⁺］i升高尤為關(guān)鍵。早期人們觀察到Ca ²⁺通道拮抗劑如verapamil、nifedipine能在體外阻斷精子獲能和頂體反應(yīng)。近年來(lái)應(yīng)用膜片鉗和人工脂雙層膜重組方法，進(jìn)一步證實(shí)在精子膜上可能存在數(shù)種Ca ²⁺通道，包括電壓依賴性Ca ²⁺通道如T型Ca ²⁺通道、L型Ca ²⁺通道，以及配體門(mén)控型Ca ²⁺通道（ligand gated Ca ²⁺channels）。分子生物學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，生精細(xì)胞能表達(dá)α1E、α1A、α1C等多種Ca ²⁺通道的亞單位，這與上述結(jié)果相吻合。此外，在成熟精子質(zhì)膜、頂體內(nèi)外膜等精子膜系中也已發(fā)現(xiàn)有多種Ca ²⁺通道存在，包括L型-Ca ²⁺通道，獲得性Ca ²⁺通道（capacitative Ca ²⁺channel）、IP3敏感性Ca ²⁺通道。

黃體酮也是通過(guò)直接或間接激活各種Ca ²⁺通道，使精子［Ca ²⁺］i升高，誘導(dǎo)精子獲能和啟動(dòng)頂體反應(yīng)。黃體酮能在數(shù)秒內(nèi)啟動(dòng)絕大多數(shù)精子［Ca ²⁺］i的第一次升高，并在20秒左右使精子［Ca ²⁺］i達(dá)其最高峰，誘導(dǎo)精子獲能。研究證實(shí)參與該過(guò)程的是精子膜受體PR1。PR1可能是配體門(mén)控型Ca ²⁺通道的一部分，PR1經(jīng)黃體酮激活后，Ca ²⁺通道開(kāi)放，引起胞外Ca ²⁺快速內(nèi)流，從而使精子［Ca ²⁺］i升高。涉及PR1的可能是一種非電壓依賴性Ca ²⁺通道，并且它的開(kāi)放和關(guān)閉與G蛋白、酪氨酸蛋白激酶也無(wú)關(guān)。

精子獲能和頂體反應(yīng)分屬同一事件的不同時(shí)相，前者是后者的基礎(chǔ)，后者是前者的發(fā)展結(jié)果，而精子［Ca ²⁺］i升高是二者發(fā)生的必要條件，但精子獲能和頂體反應(yīng)分別需要不同濃度的Ca ²⁺，獲能只需納米水平的［Ca ²⁺］i，而后者所需［Ca ²⁺］i達(dá)微米級(jí)，所以黃體酮誘導(dǎo)精子［Ca ²⁺］i第一次升高至峰值時(shí)，已足以誘導(dǎo)精子獲能，但可能不足以使精子發(fā)生頂體反應(yīng)。然而，精子［Ca ²⁺］i第一次升高后，可以再通過(guò)以下兩條信號(hào)途徑放大其效應(yīng)，如能進(jìn)一步增加［Ca ²⁺］i。其一為cAMP途徑。Ca ²⁺和cAMP兩種系統(tǒng)能在各種水平上以協(xié)同或拮抗的方式相互影響，但這種效應(yīng)取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程。就黃體酮對(duì)精子作用而言，升高精子［Ca ²⁺］i可活化腺苷酸環(huán)化酶或者抑制磷酸二酯酶（PDE），使精子內(nèi)cAMP水平增加；而后者可作用于精子頂體膜cAMP依賴性Ca ²⁺通道，導(dǎo)致精子內(nèi)鈣池頂體釋放Ca ²⁺至胞質(zhì)，進(jìn)一步升高精子［Ca ²⁺］i。其二為DAGIP3途徑。在精子膜系中存在兩種類型的磷脂酶C（PLC），一種是特異性磷脂酰膽堿PLC（PC-PLC），另一為特異性磷脂酰肌醇PLC（PI-PLC），前者活性對(duì)Ca ²⁺不敏感，后者活性依賴于Ca ²⁺。當(dāng)精子［Ca ²⁺］i升高至一定水平后，精子膜PI-PLC被激活，其水解精子膜磷脂酰肌醇生成二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）和1，4，5-三磷酸肌醇（inositol tripHospHate，IP3）；DAG隨后活化廣泛分布于精子膜的蛋白激酶C（protein kinase，PKC），PKC使精子膜上的電壓依賴性Ca ²⁺通道磷酸化并開(kāi)放。IP3通過(guò)與存在于精子頂體外膜上的特異性受體結(jié)合，開(kāi)放IP3敏感性Ca ²⁺通道，誘發(fā)頂體大量釋放Ca ²⁺。此外，與PR1相耦聯(lián)的Ca ²⁺通道對(duì)離子選擇性不甚嚴(yán)格，其開(kāi)放后，除Ca ²⁺內(nèi)流外，也有大量Na ⁺內(nèi)流。Na ⁺內(nèi)流會(huì)導(dǎo)致精子膜去極化，這已被實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。精子膜的去極化引起了膜電壓依賴性Ca ²⁺通道的開(kāi)放，使Ca ²⁺大量?jī)?nèi)流。故此，黃體酮通過(guò)與精子膜PR1結(jié)合，造成了第一次精子［Ca ²⁺］i升高，升高的［Ca ²⁺］i能進(jìn)一步誘發(fā)第二次［Ca ²⁺］i升高，這可能與之后精子發(fā)生頂體反應(yīng)有關(guān)。

部分精子膜上存在PR2。黃體酮除作用于精子膜PR1外，還能作用于PR2。黃體酮和PR2結(jié)合后，受體構(gòu)象發(fā)生變化，引起受體在數(shù)分鐘內(nèi)聚集，形成寡聚化的受體-配體復(fù)合物；約5～10分鐘后受體活化，造成精子膜蛋白酪氨酸殘基磷酸化。精子膜蛋白分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)在黃體酮作用下，發(fā)生酪氨酸殘基磷酸化的蛋白質(zhì)主要是精子膜94kDa蛋白。94kDa蛋白是精子特異蛋白，位于精子頂體區(qū)，它不僅是PR2中的酪氨酸蛋白激酶的底物，也可能是透明帶蛋白ZP3受體。精子94kDa蛋白磷酸化使膜電壓依賴性Ca ²⁺通道開(kāi)放，促進(jìn)Ca ²⁺內(nèi)流；此外，PTK與Ca ²⁺一樣也能激活PI-PLC，使磷脂酰肌醇水解為DAG和IP3，如前述，后者能導(dǎo)致Ca ²⁺內(nèi)流和頂體內(nèi)Ca ²⁺釋放，甚至PTK還能直接活化頂體膜IP3門(mén)控Ca ²⁺通道，使其開(kāi)放、釋放Ca ²⁺于胞質(zhì)內(nèi)。這樣，黃體酮和PR2結(jié)合也會(huì)造成精子［Ca ²⁺］i升高，但這至少發(fā)生于黃體酮和精子作用后5分鐘，并且經(jīng)PR2介導(dǎo)的［Ca ²⁺］i升高不依賴于經(jīng)PR1介導(dǎo)的精子第一次［Ca ²⁺］i升高。經(jīng)PR2介導(dǎo)的精子［Ca ²⁺］i升高被認(rèn)為與精子頂體反應(yīng)直接相關(guān)。

黃體酮誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)需要Cl ^-參與。無(wú)Cl ^-環(huán)境中，黃體酮不能誘發(fā)精子的頂體反應(yīng)。小鼠黃體酮受體的C262單克隆抗體能抑制黃體酮誘導(dǎo)的精子頂體反應(yīng)，同時(shí)也抑制了Ca ²⁺內(nèi)流和Cl ^-外流。這提示Cl ^-外流是黃體酮誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)的基本因素之一，但它與精子獲能無(wú)關(guān)。有研究表明，黃體酮和GABAA受體激動(dòng)劑muscimol以及GABAA一樣能誘發(fā)精子頂體反應(yīng)；而GABAA受體／Cl ^-通道阻滯劑（+）-荷包牡丹堿［（+）-bicuculline］可顯著抑制黃體酮誘導(dǎo)的精子頂體反應(yīng)。應(yīng)用熒光探針標(biāo)記方法顯示，黃體酮在誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)時(shí)有Cl ^-外流，并且Cl ^-外流可被（+）-荷包牡丹堿和另一種阻滯劑印防己苦毒素（picrotoxin）分別阻斷。這些都有力地證明了精子膜上存在GABAA受體／Cl ^-通道復(fù)合物。

應(yīng)用免疫熒光法觀察到，小牛大腦皮層的GABAA受體α-亞單位的單克隆受體能識(shí)別、結(jié)合于人精子頭部赤道區(qū)域的質(zhì)膜。以同一抗體進(jìn)行Western blot分析，從精子膜蛋白上得到了54kDa、75kDa的兩個(gè)主要反應(yīng)帶，其中，54kDa的蛋白質(zhì)與體細(xì)胞的GABAA受體α-亞單位分子量相近。同時(shí)，應(yīng)用C262單克隆抗體與人精子膜蛋白進(jìn)行Western blot分析，也得到了分子量為54kDa、75kDa的兩個(gè)主要反應(yīng)帶。這提示GABAA受體／Cl ^-通道復(fù)合物和精子膜的某些黃體酮受體可能是同一復(fù)合體，即前文所述的PR3。研究發(fā)現(xiàn)，Ca ²⁺+通道拮抗劑如verapamil、nifedipine能在體外抑制muscimol或GABAA誘發(fā)的精子頂體反應(yīng)；Ca ²⁺通道激動(dòng)劑則刺激精子頂體反應(yīng)，其作用與黃體酮具有加和效應(yīng)；GABAA受體／Cl ^-通道阻滯劑（+）-荷包牡丹堿或印防己苦毒素在抑制黃體酮誘發(fā)的精子頂體反應(yīng)和Cl ^-外流的同時(shí)，也抑制精子頭部的Ca ²⁺內(nèi)流。可見(jiàn)，GABAA受體／Cl ^-通道復(fù)合物的激活與Ca ²⁺通道關(guān)系又極為密切。

盡管如此，但是GABAA受體／Cl ^-通道復(fù)合物是如何調(diào)節(jié)頂體反應(yīng)的，尚未明確。總結(jié)已有的資料，可以假設(shè)有以下途徑，即：當(dāng)黃體酮結(jié)合于PR3后，激活GABAA受體／Cl ^-通道復(fù)合物，導(dǎo)致Cl ^-外流，使精子膜超極化，產(chǎn)生一個(gè)依賴超級(jí)化的H ⁺外流，而同時(shí)存在的Cl ^-和HCO ₃ ^-協(xié)同運(yùn)輸造成HCO ₃ ^-內(nèi)流，這些都使精子內(nèi)pH升高，進(jìn)而激活膜Ca ²⁺通道，引起精子［Ca ²⁺］i再次升高。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，酪氨酸激酶抑制劑能顯著抑制黃體酮誘導(dǎo)的Cl ^-外流，據(jù)此推測(cè)，精子膜GABAA受體／Cl ^-通道還可能和酪氨酸激酶相耦聯(lián)，形成一功能復(fù)合物，當(dāng)酪氨酸激酶激活后，不但能造成精子第二次［Ca ²⁺］i升高，而且還會(huì)引起Cl ^-外流。

綜上所述，黃體酮通過(guò)作用于精子膜上的PR1、PR2和PR3，引發(fā)了精子［Ca ²⁺］i雙相升高和Cl ^-外流（圖9-3），這些是黃體酮誘導(dǎo)精子獲能和頂體反應(yīng)的基本因素和必要條件。一般認(rèn)為，精子內(nèi)Ca ²⁺主要通過(guò)以下途徑發(fā)揮作用：①Ca ²⁺以及活化的PTK能激活精子膜系的PKC和磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2），PLA2使磷脂酰肌醇二磷酸酯（PIP2）裂解，生成大量溶血性卵磷脂，增加了精子膜、頂體內(nèi)外膜的流動(dòng)性，使精子質(zhì)膜和頂體膜易于融合；同時(shí)，PIP2的裂解使存在于精子質(zhì)膜和頂體膜之間、頂體后區(qū)致密鞘與精子質(zhì)膜之間的多聚性F-肌動(dòng)蛋白單體化，減少了精子質(zhì)膜和頂體外膜融合的阻力。②Ca ²⁺直接結(jié)合于頂體外膜，中和其磷脂極性端負(fù)電荷，以利于精子膜和頂體外膜融合。③Ca ²⁺作用于膜融合相關(guān)蛋白，使其構(gòu)象變化，促進(jìn)膜融合等。

需要指出的是，目前對(duì)誘導(dǎo)精子獲能、頂體反應(yīng)（包括黃體酮誘導(dǎo)）所需［Ca ²⁺］i升高涉及的膜Ca ²⁺通道還有爭(zhēng)論。有人認(rèn)為，獲能和頂體反應(yīng)所需的Ca ²⁺來(lái)源、Ca ²⁺通道不同，前者Ca ²⁺主要來(lái)源于胞外，膜Ca ²⁺通道為非電壓依賴性Ca ²⁺通道；后者Ca ²⁺主要來(lái)源于精子內(nèi)鈣池，Ca ²⁺通道為電壓依賴性。然而，最近資料及體細(xì)胞的研究成果提示真實(shí)機(jī)制可能遠(yuǎn)比這復(fù)雜，如現(xiàn)在較為流行的鈣池耗竭依賴性Ca ²⁺內(nèi)流（store-depletion dependent Ca ²⁺influx）理論有可能也適用于黃體酮誘導(dǎo)精子［Ca ²⁺］i升高機(jī)制，概述如下：精子外信號(hào)如黃體酮激活其PR1以及PR2耦聯(lián)的PTK，活化PI-PLC，水解磷脂酰肌醇生成IP3和DAG，進(jìn)而IP3激活精子鈣池頂體膜的IP3敏感性Ca ²⁺通道，以釋放Ca ²⁺；頂體在釋放Ca ²⁺同時(shí)，通過(guò)目前尚不清楚的途徑作用于精子膜，再由還不知道的機(jī)制激活精子膜上的一種或多種Ca ²⁺通道如獲得性Ca ²⁺通道，使其開(kāi)放，造成Ca ²⁺內(nèi)流等。

有趣的是，精子cAMP依賴性蛋白激酶A（protein kinase-A，PKA）的錨蛋白也是酪氨酸激酶胞質(zhì)作用底物之一，這提示：黃體酮誘導(dǎo)精子的cAMP激活PKA途徑與酪氨酸激酶信號(hào)途徑可能有交叉。

就誘導(dǎo)性頂體反應(yīng)而言，ZP3可能是最重要的誘導(dǎo)劑。ZP3主要通過(guò)以下可能途徑誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)（圖9-4）：①激活G蛋白耦聯(lián)型受體。在ZP3誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)中，發(fā)揮作用的G蛋白可能是Gi亞族，因?yàn)镚i亞族的特異性阻滯劑百日咳毒素能阻斷ZP3誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)。也有研究表明，Gq／11亞族參與了ZP3誘發(fā)的頂體反應(yīng)。當(dāng)G蛋白耦聯(lián)型受體激活后，還可進(jìn)一步使精子內(nèi)pH升高。②激活甘氨酸受體／Cl ^-通道。Cl ^-參與也是ZP3誘導(dǎo)的精子頂體反應(yīng)所必需，如以Br-取代孵育液中的Cl ^-，ZP3誘發(fā)的頂體反應(yīng)被抑制。但是，與黃體酮不同，（+）-荷包牡丹堿或印防己苦毒素能阻斷黃體酮誘發(fā)的精子頂體反應(yīng)，而不影響ZP3誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)，這提示精子膜上還存在另一種受體／Cl ^-通道，以介導(dǎo)ZP3誘發(fā)的頂體反應(yīng)。最近有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，精子主要是頂體周圍的質(zhì)膜上存在甘氨酸受體／Cl ^-通道復(fù)合物，該復(fù)合物的抑制劑馬錢(qián)子堿（strychine）在50nmol／L時(shí)即能顯著抑制ZP3誘發(fā)的頂體反應(yīng)，在1μmol／L時(shí)方能抑制黃體酮誘發(fā)的頂體反應(yīng)。此外，甘氨酸與ZP3一樣可誘發(fā)精子頂體反應(yīng)，該作用能被50nmol／L馬錢(qián)子堿抑制，而（+）-荷包牡丹堿則需50μmol／L才能抑制其頂體反應(yīng)；這些都充分證明了甘氨酸受體／Cl ^-通道復(fù)合物參與ZP3誘發(fā)的頂體反應(yīng)，活化的甘氨酸受體／Cl ^-通道會(huì)導(dǎo)致Cl ^-外流，以相似于黃體酮激活GABAA受體／Cl ^-通道的方式發(fā)揮作用。③T型Ca ²⁺通道開(kāi)放。當(dāng)ZP3結(jié)合于精子膜后，導(dǎo)致精子膜去極化（膜電位由-60mV升高至-30mV）。該程度的膜去極化能激活T型Ca ²⁺通道，使其開(kāi)放，造成胞外Ca ²⁺內(nèi)流，精子［Ca ²⁺］i升高；升高的［Ca ²⁺］i，以及精子內(nèi)的堿性環(huán)境，會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)精子內(nèi)鈣池持續(xù)釋放，使精子［Ca ²⁺］i再次穩(wěn)定升高。

受精是一高度復(fù)雜而嚴(yán)格有序的生理過(guò)程，廣義的受精可分為以下步驟：①精卵識(shí)別，包括精子穿透卵丘層、精子與透明帶識(shí)別和首次結(jié)合、精子頂體反應(yīng)；②精子穿透透明帶；③精卵膜融合包括卵子激活；④精卵核融合（圖9-5）。

哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞在卵丘層被放射冠細(xì)胞和透明帶包圍著。關(guān)于透明帶，研究最多的是小鼠透明帶。它是一層具有半通透性、半透明性的多孔狀結(jié)構(gòu)，厚度約6.3～7μm。目前知道，它主要由三種糖蛋白組成，按分子量從大到小分別稱為mZP1、mZP2、mZP3。透明帶蛋白能形成長(zhǎng)約2.5μm的細(xì)絲。細(xì)絲由以ZP2／ZP3異源二聚體為單體的念珠樣結(jié)構(gòu)組成。而細(xì)絲則借助ZP1／ZP2同源二聚體相互交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)使透明帶富有彈性，有利于精子穿透。

比較不同動(dòng)物的透明帶蛋白基因結(jié)構(gòu)和由之推測(cè)出的各種透明帶蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)（表9-1），可以發(fā)現(xiàn)以下信息：①不同哺乳動(dòng)物的三類透明帶蛋白ZP1、ZP2、ZP3，其對(duì)應(yīng)透明帶蛋白的基因家族外顯子組成、編碼區(qū)長(zhǎng)度以及核苷酸序列都高度同源；而同種哺乳動(dòng)物ZP1、ZP2、ZP3三類基因之間則同源性極小。②各種哺乳動(dòng)物ZP1、ZP2、ZP3三類蛋白基因家族都含有數(shù)目相近的O-連接和N-連接糖基化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)羧基端有極端疏水區(qū)。③透明帶蛋白基因家族編碼區(qū)的保守性決定了哺乳動(dòng)物透明帶具有相似的三維結(jié)構(gòu)，但各種透明帶蛋白之間也存在一些同源性較小的、具有高度特異性的生物學(xué)功能區(qū)域，這些區(qū)域可能和精卵結(jié)合的物種特異性有關(guān)。

在受精開(kāi)始階段，精子必須穿透卵丘層。卵丘層對(duì)精子具有選擇性，只允許已獲能精子穿越。早期研究發(fā)現(xiàn)，豚鼠精子表面含有一膜錨蛋白PH-20（分子量約64kDa），它通過(guò)糖基磷脂酰肌醇（glycosylp hosp hatidylinositol，GPI）錨定在精子膜上。結(jié)構(gòu)分析顯示，PH-20氨基端與透明質(zhì)酸酶有較高的同源性，它也具有一定的透明質(zhì)酸酶活性，能與其他來(lái)源的蛋白酶一起，在局部分散卵丘層的放射冠細(xì)胞，使精子穿透卵丘層。獲能精子超活化運(yùn)動(dòng)賦予了精子穿透卵丘層的動(dòng)力，故在精子穿透卵丘層過(guò)程中，它也發(fā)揮極其重要的作用。

PH-20幾乎存在于所有哺乳動(dòng)物的精子膜上，有很強(qiáng)的免疫原性。以純化的豚鼠精子PH-20免疫豚鼠能出現(xiàn)100%的抗生育效果。但是，科學(xué)家利用PH-20構(gòu)建兩種性別小鼠的避孕疫苗，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照動(dòng)物相比，雄性或雌性的生育力沒(méi)有顯著降低，可見(jiàn)重組PH-20不是小鼠免疫避孕中的有效抗原。人精子膜表面也有PH-20的同源物，其基因位于染色體7q31區(qū)域。PH-20蛋白除在穿透卵丘層發(fā)揮作用外，在以后的穿越透明帶過(guò)程中也有重要作用。

獲能精子在穿越卵丘后，將以十分精確的方式識(shí)別、結(jié)合透明帶。許多研究證實(shí)，精子頭部膜表面和透明帶的糖基互補(bǔ)配對(duì)是構(gòu)成同種精卵特異性結(jié)合的分子基礎(chǔ)，即在精子膜表面存在相應(yīng)于卵子透明帶表面的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，稱之為精子膜透明帶結(jié)合蛋白，在卵透明帶上也存在有相應(yīng)于精子透明帶結(jié)合蛋白的配基。現(xiàn)已知道，和精子首先結(jié)合的透明帶蛋白主要是ZP3。就小鼠而言，83kDa的mZP3含有O-連接和N-連接的寡糖鏈；在mZP3分子中，被精子識(shí)別、結(jié)合的是O-連接寡糖鏈（分子量約為3.9kDa的糖肽）的非還原端α-半乳糖基。當(dāng)以三氟甲烷磺酸去除小鼠ZP3的糖鏈后，ZP3就不能在體外阻斷精卵結(jié)合；以稀堿水解法去除ZP3的O-GalNAc糖鏈也會(huì)有同樣效應(yīng)。若用內(nèi)切糖苷酶切除N-連接糖鏈，ZP3仍能抑制精卵結(jié)合。可見(jiàn)，ZP3分子中的O-連接GalNAc糖鏈介導(dǎo)了精子和卵子ZP3的結(jié)合。進(jìn)一步用β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、神經(jīng)氨酸酶或β-N-乙酰氨基己糖苷酶處理卵子，發(fā)現(xiàn)卵子和精子的結(jié)合并未受影響。而純化的mZP3經(jīng)半乳糖氧化酶處理后，失去了和精子結(jié)合的能力；以NaBH4還原則又恢復(fù)其結(jié)合精子的能力，這充分表明精子識(shí)別的是其O-連接GalNAc糖鏈上的α-半乳糖基。但最近有人證實(shí)是其O-連接寡糖鏈的乙酰葡萄糖胺基在精卵結(jié)合中發(fā)揮作用。mZP3和獲能精子通過(guò)非共價(jià)鍵先是進(jìn)行松散的、可逆性結(jié)合，接著才是牢固的、不可逆性結(jié)合。在精子膜表明有數(shù)千個(gè)mZP3的結(jié)合位點(diǎn)；mZP3與之結(jié)合后，能誘發(fā)精子頂體反應(yīng)，使精子得以穿透透明帶，進(jìn)入卵周隙，接觸卵細(xì)胞膜。所以，精子識(shí)別、結(jié)合透明帶，關(guān)鍵是識(shí)別mZP3；換言之，精子膜表面存在有mZP3結(jié)合蛋白，精子膜mZP3結(jié)合蛋白和透明帶結(jié)合是受精開(kāi)始的決定性階段。作為透明帶結(jié)合蛋白，它至少應(yīng)該具備以下特征：①存在于頂體完整的精子膜表面，并能結(jié)合于ZP3；②以其抗體處理精子能阻斷精卵識(shí)別和結(jié)合；③不能結(jié)合于受精卵的透明帶；④基因敲除和基因轉(zhuǎn)染研究證實(shí)其為精卵識(shí)別所必需。大量研究表明，小鼠精子膜mZP3結(jié)合蛋白主要有三種候補(bǔ)分子，分別為：SP56、β-1，4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶和P95。

應(yīng)用親和層析法，人們從小鼠精子膜中分離得到了結(jié)合mZP3的56kDa糖蛋白，命名為SP56。SP56具有組織特異性，為睪丸組織所特有，它的mRNA僅見(jiàn)于精子細(xì)胞及變態(tài)精子。SP56是一種精子膜外周蛋白，定位于固定后頂體完整的精子頭部質(zhì)膜，每個(gè)精子上約有25 000個(gè)SP56分子，這數(shù)目與精子上ZP3的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)相近。在頂體反應(yīng)過(guò)程中，SP56有再分布現(xiàn)象，頂體反應(yīng)后，它即消失。受體-配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)它是mZP3的特異性膜結(jié)合位點(diǎn)，并主要與mZP3的O-連接寡糖鏈相識(shí)別和特異性結(jié)合，若以外源性SP56預(yù)先處理卵子，則能阻斷精卵結(jié)合。

同源性分析顯示，倉(cāng)鼠精子也含有小鼠的SP56及其mRNA的同源成分；而人及豚鼠精子沒(méi)有其同源結(jié)構(gòu)。

但是SP56作為精子膜透明帶結(jié)合蛋白仍有許多問(wèn)題有待于闡明，如：SP56與ZP3結(jié)合后能否啟動(dòng)精子頂體反應(yīng)？作為膜外周蛋白，它如何與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生聯(lián)系？它是否與跨膜蛋白耦聯(lián)？同時(shí)，至今人們還未發(fā)現(xiàn)SP56含有其他與糖基結(jié)合的蛋白質(zhì)所共有的糖基識(shí)別區(qū)（carbohydrate recognition domain，CRD）等。

GalTase能將UPDGal轉(zhuǎn)移至糖鏈末端GlcNAc上或游離Glcan上，從而生成Gal-GlcNAc。Miller等首先提出GalTase參與小鼠精卵結(jié)合，并提出了一種小鼠精卵結(jié)合的模式，即：獲能精子，通過(guò)其膜表面GalTase和mZP3分子中的GlcNAc結(jié)合，誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)；發(fā)生頂體反應(yīng)的精子與mZP2結(jié)合，并穿越透明帶，進(jìn)入卵周隙；精卵膜得以結(jié)合、融合，最終實(shí)現(xiàn)精卵核融合。目前，有以下幾方面實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持GalTase是精子膜mZP3結(jié)合蛋白：①等位基因T／t突變的T形精子膜GalTase活性增加四倍，其受精能力也相應(yīng)增加；而膜GalTase活性未發(fā)生變化的突變精子受精能力沒(méi)有變化。②活精子頭部膜表面有GalTase定位，它只能選擇性識(shí)別、結(jié)合于mZP3，而不與mZP1、mZP2發(fā)生作用。GalTase在頂體反應(yīng)過(guò)程中，從頂體區(qū)向頂體后區(qū)擴(kuò)散；頂體反應(yīng)后GalTase失去了結(jié)合mZP3的能力。③α-乳白蛋白能與底物GlcNAc競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合GalTase，提高其K _m值；當(dāng)乳白蛋白加至體外受精實(shí)驗(yàn)中，精子結(jié)合透明帶的能力受到顯著抑制。④在體外受精實(shí)驗(yàn)中，GalTase抗體或GalTase抑制劑或純化的GalTase可以作為“去能因子”，阻止精卵結(jié)合。⑤精子膜GalTase表達(dá)過(guò)量的轉(zhuǎn)基因小鼠，其精子結(jié)合mZP3能力顯著提高，并對(duì)mZP3誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)表現(xiàn)為高度敏感。⑥抗GalTase抗體結(jié)合于精子膜GalTase能激活精子發(fā)生頂體反應(yīng)；而受精的卵細(xì)胞活化后，其皮質(zhì)顆粒釋放的N-乙酰葡萄糖胺酶能修飾mZP3分子中GalTase的結(jié)合位點(diǎn)，使精子失去結(jié)合受精卵的能力，而該酶抑制劑則能阻斷其效應(yīng)等。

盡管如此，GalTase作為精子膜mZP3結(jié)合蛋白，其種屬特性、組織特異性以及結(jié)合后能在多大程度上誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)等問(wèn)題還未解決。

P95是采用受體配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法，從小鼠精子頭部膜蛋白中分離、鑒定出的。它的分子量為95kDa，為跨膜蛋白，并具有酪氨酸激酶活性，位于精子頂體區(qū)。有大量研究表明，P95是小鼠精子膜的mZP3結(jié)合蛋白，或者說(shuō)至少是mZP3與精子結(jié)合的必要成分之一，其主要依據(jù)有：①mZP3能激活從精子膜中分離的P95酪氨酸激酶活性，并增加其自身磷酸化程度；同時(shí)，mZP3在誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)時(shí)，精子頂體區(qū)P95酪氨酸磷酸化水平顯著升高。②抗P95單克隆抗體可作為“去能因子”，抑制小鼠精卵結(jié)合。③P95具有典型的酪氨酸激酶型受體特征，如配基mZP3可誘導(dǎo)精子膜P95雙聚化，激活其自身酪氨酸磷酸化，從而誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)。④酪氨酸激酶抑制劑genistein通過(guò)抑制P95活性而抑制了mZP3誘導(dǎo)獲能精子發(fā)生頂體反應(yīng)。

但是，要確定P95就是精子膜mZP3結(jié)合蛋白，還需要進(jìn)一步闡明P95的分子特征和其基因結(jié)構(gòu)；需要比較mZP3是否能與P95轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合并激活其生物學(xué)活性；需要研究P95基因敲除的動(dòng)物精子是否失去結(jié)合mZP3的能力等。

此外，20世紀(jì)80年代人們?cè)谪i精漿中發(fā)現(xiàn)了具有相似結(jié)構(gòu)（含有CUB結(jié)構(gòu)域）和相似功能的12～16kDa糖蛋白家族-精子黏附素家族（spermadherins），包括AQN-1、AQN-3、AWN，家族內(nèi)糖蛋白之間同源性高達(dá)到一個(gè)新的水平60%，精子黏附素主要由精囊腺分泌，附睪尾部也有較高表達(dá)，盡管精子黏附素分子沒(méi)有CRD同源序列，但它們?nèi)杂袕V泛的糖基結(jié)合能力。目前已知道，精子黏附素能識(shí)別糖蛋白的O-連接及N-寡糖鏈的Galβ（1-3）-GalNAc，Galβ（1-4）-GlcNAc糖基，并且與其有較高親和力；精子黏附素能以陽(yáng)離子依賴方式結(jié)合透明帶平衡解離常數(shù)達(dá)納米水平。間接免疫熒光研究證實(shí)，精子黏附素結(jié)合于經(jīng)附睪移行后的精子頭部頂體區(qū)成為精子膜外周蛋白，獲能前這些糖蛋白覆蓋于頂體區(qū)形成保護(hù)區(qū)以防精子不適時(shí)的頂體反應(yīng)，獲能后大部分精子黏附素丟失，留下部分與精子膜磷脂共價(jià)結(jié)合的黏附素，這些黏附素是精子識(shí)別、結(jié)合于豬透明帶的第一受體。體外受精實(shí)驗(yàn)也顯示，預(yù)先與精子黏附素孵育的未受精卵，其精卵結(jié)合能力被抑制。上述結(jié)果表明，精子黏附素可能為豬精子膜透明帶結(jié)合蛋白。目前，研究者在馬、牛、兔精液中及其精子膜表面也發(fā)現(xiàn)了豬精子黏附素的同源物。

目前，人和其他哺乳動(dòng)物精卵識(shí)別機(jī)制研究也積累了較多的資料（表9-2）。

綜上所述，關(guān)于精子mZP3結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)，不同的實(shí)驗(yàn)室常有不同的甚至是相互矛盾的結(jié)果，這可能與他們的實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)，同時(shí)也充分表明了精子和卵透明帶結(jié)合研究的艱巨性。另外，就與透明帶識(shí)別、結(jié)合的精子膜透明帶結(jié)合蛋白而言，相對(duì)于同一種透明帶蛋白并非只有一種透明帶結(jié)合蛋白，而是有多種，這一方面說(shuō)明精子和透明帶的相互作用涉及多因子、多步驟而十分復(fù)雜，另一方面也表明透明帶分子中的多種糖基可能同時(shí)識(shí)別、結(jié)合于不同的精子透明帶結(jié)合蛋白而啟動(dòng)精卵結(jié)合；就不同種動(dòng)物而言，精子膜透明帶結(jié)合蛋白之間同源性低，差異大，而透明帶同源性高，差異小，這一方面表明精卵透明帶結(jié)合在進(jìn)化上并非保守，至少精子膜透明帶結(jié)合蛋白如此，另一方面也可能只是我們能認(rèn)識(shí)的蛋白骨架部分不保守，而我們不了解的糖鏈部分相似性大，精卵結(jié)合過(guò)程中又恰恰是糖鏈部分發(fā)揮重要作用，這樣精卵結(jié)合在進(jìn)化上仍是保守的。

透明帶ZP3識(shí)別并結(jié)合于精子膜相應(yīng)的透明帶結(jié)合蛋白后，啟動(dòng)了精子信號(hào)系統(tǒng)，誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)。有關(guān)頂體反應(yīng)詳見(jiàn)本章第二節(jié)。

一旦啟動(dòng)AR，精子便開(kāi)始穿透卵子的ZP，該過(guò)程伴有多種酶的消化及精子尾部的劇烈運(yùn)動(dòng)。在穿透過(guò)程中，精子必須通過(guò)各種配體受體的相互作用來(lái)保證短暫的二次結(jié)合，維持與卵子外被的黏附。在小鼠模型中，早期推測(cè)ZP2可能是精子二次結(jié)合的相關(guān)受體，精子胰蛋白酶樣蛋白酶起到相應(yīng)的輔助功能。后續(xù)研究推測(cè)頂體蛋白酶前體／頂體蛋白酶是與小鼠ZP2相關(guān)的互補(bǔ)結(jié)合蛋白，在新暴露的頂體內(nèi)膜與透明帶基質(zhì)間發(fā)揮橋梁作用。豬模型的結(jié)果表明頂體蛋白酶前體能夠識(shí)別ZP1參與二次結(jié)合，隨后轉(zhuǎn)化為頂體蛋白酶，在穿透透明帶中發(fā)揮重要作用。有趣的是，這與之前報(bào)道的海膽結(jié)合蛋白與卵黃層的相互作用的機(jī)制類似。豬精子的二次結(jié)合受體可能是由赤道板遷移到后部的ZP1有關(guān)，可見(jiàn)ZP1能輔助精子穿透透明帶。該機(jī)制較為保守，因?yàn)橹亟M的豬ZP1能夠與其他五種哺乳動(dòng)物精子頭部赤道板區(qū)域結(jié)合。另外還找到了多種精-卵結(jié)合相關(guān)蛋白：①PH-20（糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白）具有透明質(zhì)酸酶活性，依賴于透明質(zhì)酸酶對(duì)ZP中的透明質(zhì)酸的不斷水解，在精子穿卵丘細(xì)胞中具有相關(guān)作用。PH-20最初定位于精子質(zhì)膜，在AR啟動(dòng)后，轉(zhuǎn)運(yùn)至頂體內(nèi)膜。②透明帶黏附素在豬、小鼠及人類精子中都有發(fā)現(xiàn)，但其活性具有種族特異性。③ZP3r是小鼠中發(fā)現(xiàn)的另一種黏附分子，可能與頂體蛋白酶一起在精子穿透卵子外被過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮作用，然而它在精子-ZP結(jié)合中的作用仍有爭(zhēng)議。

關(guān)于精子結(jié)構(gòu)參與頂體反應(yīng)激活過(guò)程的研究顯示，在人類與倉(cāng)鼠排出的精液中，只有分布于赤道板的蛋白（SPESP）參與了該過(guò)程。SPESP1敲除小鼠模型證明，SPESP1的缺失導(dǎo)致精液蛋白的分布異常，同時(shí)影響了精子的受精能力，進(jìn)一步證明了SPESP1在形成具有完整的“融合活性”的精子過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

精子穿透透明帶進(jìn)入卵周隙后，得以與卵膜相接近，隨后精子膜與卵細(xì)胞膜相互識(shí)別、結(jié)合、融合。精卵膜結(jié)合和融合是兩種不同的獨(dú)立過(guò)程，一般而言，精卵膜結(jié)合方式多樣，特異性不強(qiáng)；而精卵膜融合特異性強(qiáng)。盡管精卵膜融合機(jī)制至今未能闡明，但是有一點(diǎn)可以肯定：精卵膜融合也是以各自存在于精子膜、卵上的互相識(shí)別、相互配對(duì)的互補(bǔ)分子為基礎(chǔ)。精子膜和卵細(xì)胞膜的融合，主要發(fā)生在精子赤道區(qū)和頭后區(qū)，卵細(xì)胞的微絨毛集中區(qū)。大量研究表明，有多種細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)參與了精卵膜融合的啟動(dòng)，其中研究較為透徹的是卵膜的整合素（inegrin）和精子膜的受精素（fertilin），它們互為受體-配體關(guān)系。

整合素是由α、β亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合構(gòu)成的異二聚體跨膜蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)整合素有16種α亞基和8種β亞基，由此形成一龐大的整合素家族。整合素的α和β亞基都有一個(gè)較大的球形胞外區(qū)、一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)較短的胞質(zhì)區(qū)。β亞基的胞外區(qū)含有由56個(gè)Cys殘基組成的4個(gè)重復(fù)片段。α亞基間的氨基酸序列較β亞基間相差更大，其胞外區(qū)含有3～4個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)。有些α亞基由一條重鏈和一條輕鏈在胞外區(qū)經(jīng)二硫鍵結(jié)合而成。α亞基和β亞基的氨基末端共同構(gòu)成配基結(jié)合區(qū)。整合素的胞質(zhì)區(qū)可以與一些細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白連接，在β1亞基、β2亞基胞質(zhì)區(qū)的C端，還存在酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，它們可能是β亞基激酶的作用部位。

整合素能介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞間以及細(xì)胞和胞外基質(zhì)間的相互作用。現(xiàn)已證實(shí)在人、小鼠和倉(cāng)鼠卵細(xì)胞膜上有α2、α3、α5、α6、αv、αm、β1、β3等整合素亞基表達(dá)，但在精卵膜融合中發(fā)揮作用的，目前認(rèn)為主要是整合素α6β1，其主要依據(jù)有：①抗α6單體或抗β1多抗能抑制體內(nèi)精卵膜融合。②表達(dá)整合素α6β1細(xì)胞能結(jié)合于精子，其結(jié)合能力顯著高于只表達(dá)α6或β1的細(xì)胞。③β1亞基基因敲除的細(xì)胞結(jié)合精子能力下降75%等。

受精素，過(guò)去被稱為PH-30，是存在于精子頂體后區(qū)質(zhì)膜的一種跨膜蛋白，也是由α、β亞基組成的異二聚體。它屬于ADAM家族（A disintegrin and a metalloprotease，ADAM），具有ADAM家族成員的相似結(jié)構(gòu)，包括信號(hào)肽序列、前體區(qū)、金屬酶結(jié)構(gòu)域、解離素結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸區(qū)、表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)單元、跨膜區(qū)和短胞質(zhì)區(qū)（圖9-6）。

其中解離素結(jié)構(gòu)域與整合素有高度親和力，而且重組的解離素肽段能在體外促進(jìn)脂質(zhì)體的融合。受精素的α、β亞基在整合至精子膜的前后經(jīng)歷了一系列加工過(guò)程。但是，α、β亞基的加工分別發(fā)生于精子發(fā)育的不同階段。α亞基的加工進(jìn)行于睪丸精子發(fā)生過(guò)程中，主要是蛋白酶切去金屬酶結(jié)構(gòu)域和解離素結(jié)構(gòu)域；β亞基的加工是在附睪精子成熟過(guò)程中完成的，主要是切去金屬酶結(jié)構(gòu)域。以下一些實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，精子膜受精素作為整合素的受體，在精卵膜融合中有重要作用：①受精素定位于精子頭部頂體后區(qū)，而精卵膜融合啟動(dòng)首先發(fā)生于該區(qū)域。②抗受精素抗體能在體外抑制精卵結(jié)合。③序列分析顯示受精素β亞基的成熟形式含有解離素結(jié)構(gòu)域，α亞基的成熟形式無(wú)解離素結(jié)構(gòu)域，但含有病毒融合蛋白的同源序列；重組的受精素β亞基能與卵膜結(jié)合，并抑制體外精卵膜融合，而無(wú)解離素的α亞基不能結(jié)合于卵膜；重組的α亞基無(wú)論有否解離素都能與卵膜有效結(jié)合，并均可在體外抑制精卵膜融合，這表明受精素的β亞基可能主要結(jié)合與卵膜整合素，α亞基可能參與膜融合。④編碼β亞基解離素結(jié)構(gòu)域的外顯子（受精素第14外顯子）被敲除后，雄性小鼠（受精素β-／-）的精子數(shù)量、形態(tài)、活動(dòng)力均正常；獲能和自發(fā)性頂體反應(yīng)的發(fā)生率以及所需時(shí)間都與正常小鼠無(wú)顯著差異。但是在體外，這些小鼠精子與去透明帶的卵母細(xì)胞結(jié)合、融合能力顯著低于正常小鼠。有意義的是受精素β-／-雄性小鼠的精子，失去了結(jié)合透明帶的能力；并且精子能順利進(jìn)入子宮腔，活力、形態(tài)均正常，但這些精子不能到達(dá)輸卵管。

受病毒與宿主細(xì)胞融合模型啟發(fā)，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)資料，有人提出了一種精卵膜融合的模式，概述如下：精子發(fā)生頂體反應(yīng)后，其質(zhì)膜表面與融合相關(guān)成分進(jìn)一步聚集，如受精素；聚集的精子受精素β亞基和卵膜整合素相互作用，誘導(dǎo)受精素的構(gòu)象變化，暴露受精素α亞基的融合蛋白結(jié)構(gòu)域；融合蛋白結(jié)合于卵膜親水區(qū)α螺旋或β片層結(jié)構(gòu)，形成融合蛋白復(fù)合體；誘導(dǎo)精卵膜的半融合，從而啟動(dòng)精卵膜融合，隨后在卵膜上形成融合小孔并最后開(kāi)放，使精子核進(jìn)入卵細(xì)胞內(nèi)。

然而，精卵膜融合是否就是受精素和整合素相互作用的結(jié)果仍有許多問(wèn)題有待于實(shí)驗(yàn)證實(shí)，如至今仍沒(méi)有獲得精子受精素和卵膜整合素直接作用的證據(jù)；同時(shí)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要來(lái)自于小鼠，人及其他哺乳動(dòng)物精卵膜融合可能與其存在不同之處，如人類有小鼠受精素β亞基的同源基因，但只有α亞基的假基因，這表明人類精卵膜融合可能沒(méi)有受精素α亞基的參與，人類精卵膜融合可能存在其他機(jī)制。

當(dāng)精卵膜融合時(shí)其他精子再進(jìn)入即被阻止，以防止多精受精。對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，多精受精是有害的；即使受精，其胚胎也會(huì)早期死亡，這是確保物種穩(wěn)定的重要手段。然而，兩棲類和鳥(niǎo)類受精時(shí)，允許多精子進(jìn)入卵細(xì)胞，但多余的精子在卵細(xì)胞內(nèi)會(huì)被破壞。在精卵融合的短時(shí)間內(nèi)，卵子透明帶的精子受體迅速發(fā)生分子修飾，失去與精子結(jié)合的能力，從而阻止其他精子黏附，這是一種快速阻斷多精受精的機(jī)制。而受精膜的形成則為另一種永久阻斷多精受精的機(jī)制，詳見(jiàn)本節(jié)“卵子激活”。

受精前的卵母細(xì)胞停留在第二次減數(shù)分裂的分裂中期，細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成基本停止，細(xì)胞代謝處于高度抑制狀態(tài)。只有當(dāng)精子膜和卵母細(xì)胞膜結(jié)合、融合后，才能解除卵母細(xì)胞的這種代謝抑制狀態(tài)，使卵母細(xì)胞從“沉睡”狀態(tài)被喚醒，恢復(fù)并完成第二次減數(shù)分裂，啟動(dòng)胚胎早期發(fā)育程序，該過(guò)程即為卵子激活。

卵子激活觸發(fā)了一連串事件，包括：

細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子水平的上升幾乎是一個(gè)普遍的信號(hào)分子，能夠觸發(fā)導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活的一系列事件的發(fā)生。前期研究證實(shí)鈣離子載體能夠誘導(dǎo)卵母細(xì)胞激活，海洋動(dòng)物中首次發(fā)現(xiàn)鈣離子水平的暴發(fā)性升高，提示離子峰能夠誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的激活。隨后在其他物種中也發(fā)現(xiàn)了鈣離子的改變，說(shuō)明這是一個(gè)在各物種間保守的卵母細(xì)胞激活過(guò)程相關(guān)的事件。胞質(zhì)中鈣離子的大量增加表現(xiàn)出很多樣的形式，包括非哺乳動(dòng)物中單一的短暫的離子峰的出現(xiàn)，和哺乳動(dòng)物當(dāng)中周期性的擺動(dòng)的出現(xiàn)，其幅度和頻次對(duì)于成功的卵母細(xì)胞激活和胚胎的發(fā)育有著重要作用。研究證實(shí)在金色倉(cāng)鼠中，卵母細(xì)胞在和精子相互作用以后反復(fù)的高極化狀態(tài)和周期性的鈣離子濃度變化相關(guān)。這種觀點(diǎn)進(jìn)一步在小鼠卵母細(xì)胞當(dāng)中得到了證實(shí)，激活的卵母細(xì)胞當(dāng)中出現(xiàn)了持續(xù)的鈣離子振蕩，它是從短暫的升高開(kāi)始，并保留在某個(gè)程度持續(xù)約2到30分鐘甚至幾小時(shí)。首次直接檢測(cè)到人類卵母細(xì)胞受精時(shí)胞質(zhì)當(dāng)中的鈣離子濃度改變?cè)缭?0世紀(jì)90年代。這些學(xué)者同時(shí)研究了含透明帶和去透明帶的受精后的卵母細(xì)胞，記錄其各自細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度瞬間改變的幅度、持續(xù)時(shí)間和頻率，結(jié)果與小鼠當(dāng)中檢測(cè)到的相似。事實(shí)證明鈣離子振蕩是細(xì)胞周期依賴的，它們?cè)谠诵纬蓵r(shí)停止了，而這個(gè)時(shí)期被認(rèn)為是卵母細(xì)胞激活的終點(diǎn)。

早期研究已表明，受精誘導(dǎo)Ca ²⁺波的Ca ²⁺主要來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的Ca ²⁺釋放，但胞外Ca ²⁺對(duì)于Ca ²⁺波的維持至關(guān)重要。在無(wú)胞外Ca ²⁺的環(huán)境下，精卵融合仍可誘導(dǎo)卵母細(xì)胞內(nèi)Ca ²⁺波動(dòng)數(shù)次，但很快終止。若在胞外環(huán)境中加入Ca ²⁺后，卵母細(xì)胞Ca ²⁺波仍可恢復(fù)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，升高胞外Ca ²⁺濃度可使Ca ²⁺波的頻率加快；而降低胞外Ca ²⁺濃度則會(huì)放慢Ca ²⁺波的頻率。

后來(lái)的研究證實(shí)鈣離子振蕩也是非哺乳動(dòng)物比如不同的海鞘類物種的卵母細(xì)胞激活的必要特征。過(guò)去的幾十年的研究主要集中在鈣離子信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化方面，探討鈣離子波和振蕩是如何轉(zhuǎn)化為卵母細(xì)胞應(yīng)答的。在棘皮動(dòng)物中，胞質(zhì)膜的去極化導(dǎo)致電壓特異性的鈣離子通道開(kāi)放，從而引發(fā)了鈣離子進(jìn)入質(zhì)膜，導(dǎo)致鈣離子的首次升高。而這種鈣離子內(nèi)流會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的去極化，對(duì)于防止多精受精發(fā)著了作用。在大多數(shù)情況下，鈣離子的內(nèi)流是由鈣離子庫(kù)的耗盡所介導(dǎo)的，這種機(jī)制被稱作容受性鈣離子內(nèi)流或者操縱性鈣內(nèi)流（SOCE）。在這種機(jī)制中有很多中分子的參與，包括STIM、ORAI、SERCA等共同重新填滿鈣離子庫(kù)用以產(chǎn)生新的鈣離子振蕩。雖然后者是鈣離子內(nèi)流的普遍接受的機(jī)制，但是在小鼠卵母細(xì)胞激活的完成過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了另一種離子通道活性的機(jī)制，認(rèn)為SOCE并不是唯一的機(jī)制。鈣離子庫(kù)的形成主要來(lái)源于光面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，光面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含有IP3和蘭諾定受體。IP3Ⅰ型受體在哺乳動(dòng)物的鈣離子振蕩過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。除外IP3，其他的鈣離子流動(dòng)的介質(zhì)，被稱為異卵雙生信使的cADPR和煙酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAADP），參與到了細(xì)胞內(nèi)的鈣離子庫(kù)的調(diào)動(dòng)。雖然cADPR和NAADP都沒(méi)有被完全研究清楚，但是前者被認(rèn)為能夠調(diào)動(dòng)蘭諾定受體介導(dǎo)的CICR，在海膽的卵母細(xì)胞當(dāng)中證實(shí)cADPR參與到了NO刺激的鈣離子調(diào)動(dòng)通路。在同一物種當(dāng)中研究發(fā)現(xiàn)NAADP誘導(dǎo)的鈣離子上升似乎是由一種新的鈣離子通道稱作雙孔通道所調(diào)控的。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于信使、細(xì)胞內(nèi)鈣離子庫(kù)和離子通道在卵母細(xì)胞受精后激活時(shí)的鈣離子波的發(fā)生中協(xié)同作用有了新的闡述。鈣離子振蕩是如何發(fā)生的以及它發(fā)生以后的下游事件一直是研究的主題。值得注意的是，鈣離子和細(xì)胞周期控制元件相互作用的機(jī)制依賴于APC和細(xì)胞周期蛋白的降解。然而，鈣離子信號(hào)是如何誘導(dǎo)減數(shù)分裂重新啟動(dòng)的分子機(jī)制依然不清楚。

Ca ²⁺波的出現(xiàn)和維持是卵子激活的物質(zhì)基礎(chǔ)和中心環(huán)節(jié)。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)游離Ca ²⁺濃度升高可介導(dǎo)卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒釋放。［Ca ²⁺］i升高，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子（cytostatic factor，CSF）（CSF是c-mos表達(dá)產(chǎn)物，其活性只出現(xiàn)于生殖細(xì)胞）活性消失并不再回升。CSF活性消失造成cyclinB去磷酸化以及降解，隨之，成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF）活性消失，磷酸酶活性增強(qiáng)，去磷酸化反應(yīng)過(guò)程加強(qiáng)，啟動(dòng)細(xì)胞周期，使休止于第二次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞恢復(fù)分裂，完成第二次減數(shù)分裂并啟動(dòng)胚胎早期發(fā)育程序。

研究發(fā)現(xiàn)［Ca ²⁺］i升高一次即足以誘導(dǎo)皮質(zhì)顆粒釋放并激活卵子，如通常使用乙醇、鈣離子載體或電刺激處理卵子都可誘導(dǎo)卵子孤雌激活，而這些刺激一般僅誘導(dǎo)卵母細(xì)胞［Ca ²⁺］i升高一次。但是，孤雌激活成功與否取決于卵齡，卵齡越大越容易激活。上述誘導(dǎo)卵子孤雌激活的理化刺激不能有效激活剛排出不久的卵子。若用多次電刺激誘導(dǎo)卵子多次［Ca ²⁺］i升高，模擬受精誘導(dǎo)的Ca ²⁺波，則發(fā)現(xiàn)多次［Ca ²⁺］i升高誘導(dǎo)的卵子激活率及激活后卵子發(fā)育成囊胚的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一次［Ca ²⁺］i升高。這表明Ca ²⁺波可能對(duì)胚胎發(fā)育有重要作用。

Ca ²⁺波引起皮質(zhì)顆粒快速、大量釋放皮質(zhì)顆粒是位于卵膜下的與溶酶體相似的細(xì)胞器，直徑20～30nm，其內(nèi)容物具有水解酶活性。在Ca ²⁺波的作用下，皮質(zhì)顆粒釋放其內(nèi)容物至卵周隙，一方面產(chǎn)生游離的、能膨脹的凝膠狀物質(zhì)，另一方面其釋放的水解酶對(duì)透明帶蛋白進(jìn)行修飾，改變了透明帶的性質(zhì)，使之硬化（hardening），起到永久阻斷多余的精子進(jìn)入的作用，這對(duì)于防止多精受精具有重要意義。

同時(shí)，精卵融合時(shí)，卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜也發(fā)生了變化，使其不再與其他精子結(jié)合，從而也有阻止多精受精的作用。

［Ca ²⁺］i升高，以及細(xì)胞內(nèi)pH升高，這些變化使得儲(chǔ)存在核糖核蛋白顆粒中的mRNA釋放，并有新蛋白表達(dá)，如大量的組蛋白就在此時(shí)生成，為卵裂過(guò)程中染色體復(fù)制做準(zhǔn)備。

精卵融合時(shí)，精子的線粒體隨精子核一起進(jìn)入卵母細(xì)胞。遺傳學(xué)分析表明，只有卵母細(xì)胞的線粒體存活，精子的線粒體迅速消失。受精前，卵內(nèi)的線粒體分布均勻；受精后，線粒體先是位于雌原核周圍，在紡錘體形成時(shí)，它則位于紡錘體的兩極。受精時(shí)，卵母細(xì)胞內(nèi)的中心體已消失，精子核附近的中心體在穿入卵后，發(fā)出許多微管束，形成一所謂spermaster的結(jié)構(gòu)，它在吸引雌原核靠近雄原核過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

見(jiàn)本節(jié)精卵核融合部分。

卵子激活的機(jī)制仍未完全闡明，概括已有的研究資料，主要有兩種學(xué)說(shuō)，即受體學(xué)說(shuō)和融合學(xué)說(shuō)。

許多人認(rèn)為卵子激活的發(fā)生機(jī)制類似于體細(xì)胞，即精卵膜融合時(shí)，精子表面配基結(jié)合并激活卵細(xì)胞膜相應(yīng)受體，生成第二信使；第二信使觸發(fā)了胞內(nèi)瀑布式的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而激活卵子。目前有三種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型學(xué)說(shuō)被認(rèn)為與卵子激活相關(guān)，即：G蛋白及其耦聯(lián)受體介導(dǎo)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)說(shuō)，整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)說(shuō)，酪氨酸蛋白激酶受體介導(dǎo)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)說(shuō)（圖9-7）。

該模型認(rèn)為在精卵膜融合時(shí)，精子膜上的配基與卵母細(xì)胞膜表面的相應(yīng)精子受體結(jié)合，激活了與其耦聯(lián)的G蛋白，隨之PLC被活化；PLC使膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）裂解產(chǎn)生第二信使物質(zhì)IP3和DAG。水溶性的IP3進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，首先與卵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上IP3敏感性鈣庫(kù)的IP3受體相結(jié)合，導(dǎo)致Ca ²⁺從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放入胞質(zhì)；局部釋放的Ca ²⁺又可刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附近的ryanodine敏感性鈣庫(kù)引起Ca ²⁺進(jìn)一步釋放。儲(chǔ)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca ²⁺的分別被分隔成獨(dú)立的部分在起作用。從第一個(gè)分隔體釋放的Ca ²⁺刺激第二個(gè)分隔體中Ca ²⁺的釋放，依此類推，Ca ²⁺沿鈣庫(kù)排列方向向胞質(zhì)其他方向呈暴發(fā)性傳遞至整個(gè)卵母細(xì)胞，形成所謂Ca ²⁺波。鈣庫(kù)排空后對(duì)IP3和ryanodine的敏感性立即降低，使排空的鈣庫(kù)對(duì)外來(lái)的連續(xù)刺激產(chǎn)生一個(gè)不應(yīng)期。與此同時(shí)，鈣庫(kù)Ca ²⁺排空后會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生一種信號(hào)分子，開(kāi)放質(zhì)膜上的Ca ²⁺通道，使胞外Ca ²⁺內(nèi)流，即前述的鈣池耗竭依賴性Ca ²⁺內(nèi)流。胞外Ca ²⁺內(nèi)流后使排空的鈣庫(kù)再次充盈，并恢復(fù)對(duì)IP3和ryanodine的敏感性，從而引起第二次Ca ²⁺釋放。這種周而復(fù)始的過(guò)程導(dǎo)致卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca ²⁺的時(shí)空變化以有規(guī)律的Ca ²⁺波形式出現(xiàn)。同時(shí)，脂溶性的DAG整合于卵膜中，激活PKC。被激活的PKC催化卵母細(xì)胞內(nèi)多種特異性底物磷酸化，包括細(xì)胞膜上的離子通道，由此，卵子激活。

支持G蛋白及其耦聯(lián)受體介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)模型的實(shí)驗(yàn)依據(jù)有以下幾類：①G蛋白以及G蛋白下游分子的激動(dòng)劑或拮抗劑的應(yīng)用：將GTPγs用微注射方法引入未受精的卵母細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，GTPγs能誘導(dǎo)與受精時(shí)相似的［Ca ²⁺］i升高和Ca ²⁺波特征，并有皮質(zhì)顆粒釋放。在未受精的卵母細(xì)胞中微注射入IP3后，卵母細(xì)胞也有與受精一致的表現(xiàn)。若以GDPβs注射入卵母細(xì)胞，則可抑制受精誘導(dǎo)的升高，但不能阻斷微注射IP3誘導(dǎo)的Ca ²⁺反應(yīng)。若將抗IP3受體微注射入未受精的卵母細(xì)胞，則能產(chǎn)生相似于受精誘導(dǎo)的Ca ²⁺變化以及卵子激活的一系列反應(yīng)。②轉(zhuǎn)基因研究：應(yīng)用乙酰膽堿處理膜上表達(dá)有人乙酰膽堿受體的小鼠卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞出現(xiàn)卵子激活的一系列現(xiàn)象；阿托品、GDPβs則可阻斷乙酰膽堿的效應(yīng)。應(yīng)用5-HT處理豚鼠卵母細(xì)胞或以carbachol處理小鼠卵母細(xì)胞，也能產(chǎn)生受精類似的反應(yīng)。

此外，小G蛋白對(duì)卵子激活，尤其是對(duì)卵子激活后期反應(yīng)具有十分重要的作用。如將ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶C3（小G蛋白R(shí)ho的抑制劑）注入卵母細(xì)胞，盡管不能阻斷受精后的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和皮質(zhì)顆粒釋放，但能抑制卵母細(xì)胞排出第二極體和卵裂。

近年來(lái)，關(guān)于整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究已取得了很大的進(jìn)展。研究表明，當(dāng)整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活后，可活化多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括：①導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離Ca ²⁺濃度升高；②使胞內(nèi)pH升高；③激活黏附蛋白激酶（FAK）、整合素相關(guān)激酶（ILK）等酪氨酸蛋白激酶；④激活PKC；⑤活化RhO、磷酸肌醇-4-磷酸-5-激酶（PI-3k）和磷酸肌醇-4-磷酸-5-激酶；⑥MAPK和JNK通路被激活等。故整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，在受精、細(xì)胞增殖、分化等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

精卵膜融合可能是卵細(xì)胞膜上的整合素與精子膜相應(yīng)的配基受精素相互作用的結(jié)果，所以，卵子激活可能由整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)啟動(dòng)。有以下一些證據(jù)支持該模型：①整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的啟動(dòng)可因整合素區(qū)域性分布及其聚集程度不同而異，而精卵膜融合也具有高度區(qū)域性特征，二者有相似之處。②卵子激活后的代謝活化，原核形成、有絲分裂啟動(dòng)等細(xì)胞生理活動(dòng)，與整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活后的細(xì)胞反應(yīng)有較高的一致性。③RGD能使卵子激活。但是，最近有實(shí)驗(yàn)顯示，卵子激活與整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑無(wú)關(guān)。受精素β-／-雄性小鼠的精子與卵子融合后，仍然發(fā)生卵子激活，并且與正常小鼠卵子激活無(wú)任何差異。

有實(shí)驗(yàn)顯示，酪氨酸激酶抑制劑能特異性阻斷海膽卵子受精的原核形成、DNA合成、卵裂。應(yīng)用PDGF或FGF處理表達(dá)PDGF和FGF嵌合型受體的海膽卵子；應(yīng)用EGF處理表達(dá)EGF受體的爪蟾卵子，它們能分別導(dǎo)致海星卵子、爪蟾卵子的［Ca ²⁺］i升高以及形成受精膜（fertilizational euvolpe）。這充分證明了酪氨酸蛋白激酶受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了低等動(dòng)物卵子結(jié)合。

小鼠卵子激活后也發(fā)生了一系列蛋白酪氨酸殘基磷酸化，但至今仍不清楚酪氨酸蛋白激酶受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)途徑在卵子激活中是否扮演重要角色。而其實(shí)哺乳動(dòng)物卵子激活后期的一些細(xì)胞活動(dòng)也提示，酪氨酸蛋白激酶受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能參與了哺乳動(dòng)物的卵子激活。

融合學(xué)說(shuō)認(rèn)為，精子內(nèi)存在某種可溶性因子，在精卵膜融合時(shí)，進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)，作用于卵母細(xì)胞內(nèi)靶結(jié)構(gòu)，隨之卵子激活（圖9-8）。

早在20世紀(jì)80年代初，人們就注意到，精卵膜融合和卵母細(xì)胞［Ca ²⁺］i升高之間有一時(shí)間“延遲”。如海膽精卵膜融合至海膽卵母細(xì)胞［Ca ²⁺］i升高、皮質(zhì)顆粒釋放有10～15秒的間隙；爪蟾卵母細(xì)胞［Ca ²⁺］i升高也發(fā)生于精卵融合后，于是有人提出精卵膜融合時(shí)，精子內(nèi)某種因子進(jìn)入了卵子內(nèi)，啟動(dòng)了卵子激活。如海膽精子提取物可直接活化海膽卵子并能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞［Ca ²⁺］i升高和皮質(zhì)顆粒釋放。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，豚鼠、兔、牛精子可溶性抽取物注入相應(yīng)的卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，均能導(dǎo)致卵膜去極化，以及表現(xiàn)有與受精相類似的Ca ²⁺波和皮質(zhì)顆粒釋放、原核形成、卵裂等。有趣的是，將公牛精子的可溶性抽提物注入小鼠或豚鼠卵母細(xì)胞，分別能誘導(dǎo)相似于其對(duì)公牛卵母細(xì)胞的反應(yīng)。大量的實(shí)驗(yàn)證明精子進(jìn)入卵子的是可溶性蛋白因子而非IP3、cGMP、cAMP、DAG、Ca ²⁺等能直接誘導(dǎo)細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第二信使物質(zhì)，并且這種因子是精子所特有的。

最近從豚鼠精子中分離了一種能誘導(dǎo)豚鼠卵母細(xì)胞產(chǎn)生Ca ²⁺的蛋白質(zhì)，分子量為33kDa，被命名為“oscillin”。它位于精子頂體附近，可能在精子膜融合時(shí)被帶入卵母細(xì)胞。其基因也已被克隆。值得注意的是，它是葡萄糖胺-6-磷酸酶的同工酶。

有人報(bào)道，僅將精子核注入卵子也可激活卵子，這表明除胞質(zhì)中有激活卵子的信號(hào)外，在胞核中也可能存在。

然而，融合學(xué)說(shuō)仍存在較多缺陷，有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。如：①受體介導(dǎo)的卵子激活，在精卵膜融合與Ca ²⁺波形成之間也有時(shí)間“延擱”。②精子抽提物注入實(shí)驗(yàn)中，精子抽提物的注入量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于受精時(shí)單個(gè)精子注入的可溶性因子量。③精子抽提物注入實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度易變，穩(wěn)定性差。④oscillin注入僅能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞Ca ²⁺形成，是否能導(dǎo)致皮質(zhì)顆粒釋放、原核形成還不清楚；其基因表達(dá)產(chǎn)物是否能直接模擬受精誘導(dǎo)的Ca ²⁺波，其抑制劑能否阻斷受精誘導(dǎo)的Ca ²⁺波等，尚不可知。

由此可見(jiàn)，受體學(xué)說(shuō)和融合學(xué)說(shuō)都有各自的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但也有各自無(wú)法解釋的問(wèn)題。受精時(shí)，卵子激活可能有受體參加，也可能同時(shí)有精子內(nèi)可溶性蛋白參與。

受精后較短時(shí)間內(nèi)，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂重現(xiàn)開(kāi)始，卵母細(xì)胞只有在MPF和MAPK活性的大幅度下降以后，才能退出減數(shù)分裂后期進(jìn)入間期。在多數(shù)不同的物種中，Emil2的降解會(huì)刺激APC復(fù)合物的蛋白酶解，從而觸發(fā)周期蛋白B的蛋白水解，最終導(dǎo)致MPF活性的下降。Emil2／Erpl以及cyclinB和MPF間的相互作用是減數(shù)分裂重新開(kāi)始過(guò)程當(dāng)中的關(guān)鍵事件，特別是對(duì)中期到后期的轉(zhuǎn)化以及極體的排出過(guò)程。然而這一觀點(diǎn)也是有爭(zhēng)議的，特別是在小鼠當(dāng)中，直到原核形成前MAPK還是無(wú)活性的狀態(tài)。在卵母細(xì)胞當(dāng)中，受鈣離子釋放影響并參與到細(xì)胞周期重新啟動(dòng)的因子包括有PKC、CAMKII和鈣調(diào)磷酸酶，而其下游影響因素是激酶和磷酸酶。CAMKII γ亞型敲除的小鼠不能夠激活CSF和MPF。基于這個(gè)發(fā)現(xiàn)以及其他在脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物當(dāng)中的研究，CAMKII似乎作為一個(gè)鈣離子信號(hào)刺激后關(guān)鍵的中間介質(zhì)，最終導(dǎo)致Emil2／Erpl的磷酸化和水解。隨著其水解，Cdk I／cyclin B會(huì)失活并發(fā)生減數(shù)分裂的重新啟動(dòng)。這種機(jī)制被認(rèn)為是鈣離子釋放和MPF失活之間的聯(lián)系。其他一些鈣離子和MPF失活之間的關(guān)聯(lián)尚需進(jìn)一步的研究。然而，在某些哺乳動(dòng)物當(dāng)中，CSF降解的延遲也許和Mos的降解和MAPK的失活相關(guān)，這一理論在海鞘的卵母細(xì)胞當(dāng)中也得以證實(shí)。

目前的研究主要集中在鋅離子水平的下降，其似乎同時(shí)參與到了卵母細(xì)胞激活和減數(shù)分裂重新開(kāi)始的激活通路當(dāng)中。在小鼠當(dāng)中，鋅離子是卵母細(xì)胞受精時(shí)釋放的，并且似乎是受到鈣離子信號(hào)誘導(dǎo)的。鋅離子釋放也證實(shí)與Emil2活性的調(diào)節(jié)和Cdk1／Cdc2的磷酸化有關(guān)，從而參與到了減數(shù)分裂重新開(kāi)始的過(guò)程。特別的是，哺乳動(dòng)物受精時(shí)檢測(cè)到的鋅離子峰證實(shí)與母胚轉(zhuǎn)換過(guò)程相關(guān)，確立了哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂細(xì)胞周期調(diào)控中鋅離子依賴的通路的作用。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂重新啟動(dòng)非必需的大分子物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和RNA，也發(fā)生了巨大的變化。蛋白質(zhì)組成成分的改變是其主要特征，主要表現(xiàn)為母源蛋白的大量降解。發(fā)生這些改變主要是因?yàn)榘l(fā)生了一系列的蛋白質(zhì)降解、磷酸化、翻譯后修飾以及新的母源RNA的翻譯。胞質(zhì)的多聚腺苷酸化包括mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)以后polyA尾的延長(zhǎng)。這種現(xiàn)象在很多物種，包括脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物當(dāng)中的卵母細(xì)胞和早期胚胎中都有所發(fā)現(xiàn)，并被普遍認(rèn)為是某些特異的mRNA進(jìn)行蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。這一過(guò)程（胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件以及它們所結(jié)合的蛋白質(zhì)）的介質(zhì)已經(jīng)被研究得非常細(xì)致，并且最近也有了新的發(fā)現(xiàn)。小鼠早期胚胎中母源mRNA的降解是從卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的最后階段開(kāi)始的。可降解的母源RNA和蛋白質(zhì)的降解是植入前胚胎發(fā)育的一個(gè)普遍特征，并持續(xù)到母胚轉(zhuǎn)換時(shí)期，甚至在某些情況下還會(huì)持續(xù)得更久。早期胚胎中mRNA的選擇性降解的機(jī)制尚不清楚，不過(guò)有研究顯示microRNA似乎會(huì)影響翻譯的過(guò)程從而在這個(gè)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮了有趣的作用。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)后，將會(huì)完成第二次減數(shù)分裂，排出第二極體，卵母細(xì)胞形成了形態(tài)不規(guī)則，最后轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐蔚拇圃恕Ｔ诋?dāng)精子核進(jìn)入卵子內(nèi)，在類固醇激素調(diào)控下，卵子內(nèi)的雄原核生長(zhǎng)因子，使精子核膜解體，高度濃縮的染色質(zhì)腫脹、解聚，新的核膜形成，此稱為雄原核。在細(xì)胞骨架的作用下，雌原核、雄原核相互靠近，最后完全融合；隨后，染色體濃縮，原核膜破裂、消失，精卵染色體組合于一起，形成了合子染色體組，受精至此結(jié)束。

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