- 實用兒童微生態學
- 黃志華 鄭躍杰 武慶斌
- 3588字
- 2020-08-27 16:57:52
第六節 無菌動物和悉生動物技術
普通動物是在開放系統條件下飼養的，均受到自然界微生物和寄生蟲的侵襲，一般都帶細菌、病毒和寄生蟲。有的動物外觀看起來健康，其實都隱藏著某些疾病或有微生物與寄生蟲的感染。因此用普通動物進行實驗和研究，將會存在各種各樣的干擾，實驗結果往往不確切。要提高動物實驗的準確性，就必須對實驗動物在遺傳和微生物兩個方面加以控制，培養出標準的合格動物，才能使實驗結果正確可靠，達到反應均一性和重復性。采用兄妹間近親交配繁殖20代以上所培育的近交系動物，遺傳均一、個體差異小、實驗結果比較準確。但是只從遺傳上加以控制，如不進行微生物控制，沒有排除自然感染的微生物和寄生蟲的影響，實驗結果仍可能不準確。因此，在精度要求高的實驗中，無菌動物、悉生動物和無特殊病原體動物就成了理想的實驗動物。
由于微生態學研究的主要內容之一是正常微生物群對宿主的影響，因此無菌動物和悉生動物技術自然就成為微生態學研究的極好手段。無菌動物和悉生動物為研究正常菌群對宿主的生物拮抗、營養代謝和免疫作用提供了極為重要的方法。通過比較無菌動物、悉生動物和普通動物或定植人糞便菌群的無菌動物如人糞便化小鼠（humanized-mice），可以確定特定菌群的作用。
一、無菌動物和悉生動物的基本概念
按對微生物的控制的程度，可以將實驗動物分為四類：①無菌動物（germ free，GF）；②悉生動物或已知菌動物（gnotobiotics，GN）；③無特定病原體動物（specific pathogen free，SPF）；④普通動物（conventional，CV）。無菌（germ free）動物是在無菌屏障系統中，剖腹取出胎兒，飼養繁育在無菌隔離器中，飼料、飲水經過消毒，定期檢驗，證明動物體內外均無一切微生物和寄生蟲（包括大部分病毒）的動物。無菌動物的“菌”主要是指細菌，而嚴格來說，還包括真菌、立克次體、支原體和病毒等微生物及各種寄生蟲。而所謂“無菌”不是絕對的，不過是根據現有的科學知識和檢查方法在一定時期內不能檢出已知的微生物和寄生蟲而已。
用大量抗生素也可以使普通動物暫時無菌，但是這種動物不是無菌動物。因為這種無菌狀態往往是一過性的，某些殘存的細菌在適當的條件下又會在體內增殖；即使能把體內細菌全部殺死，它們給動物造成的影響卻是無法消除的，例如：特異性抗體的存在、網狀內皮膚系統的活化、某些組織或器官的病理變化等。因此，無菌動物必須是生來就無菌的。
悉生動物（gnotobiotic animals）也稱已知菌動物或已知菌叢動物（anima with known bacterial flora），是指用與無菌動物相同的方法取得飼養（剖腹取胎，在隔離器內飼養）、并明確體內給予了已知微生物的動物，即凡含有已知的單菌（monoxenie）、雙菌（dixenie）、三菌（trixenie）或多菌（polyxenie）的動物。一般是將1～3種已知的微生物人工接種于無菌動物體內定居，無菌動物接種一種已知菌就是單菌動物，以此類推。由于此種動物和無菌動物一樣是放在無菌隔離器內飼養的，因此選用此種動物做實驗準確性是很高的，可排除動物體內帶有的各種不明確的微生物對實驗結果的干擾，常用于研究微生物和宿主動物之間的關系，并可按研究目的來選擇某種微生物。
悉生動物是特定的微生物定居于無菌動物的動物，可以說是一種動物與微生物的復合體，也飼養于隔離器中，飼養方法與無菌動物相同。由于這種動物是有菌的，所以隔離器內也有這種微生物的存在。
二、無菌動物的特征
只要飼料配備適當，無菌動物發育正常，外觀和普通動物相同，但是其功能、結構和普通動物有很大的不同。無菌動物受兩個因素影響，即微生物和因飼養比較聚集而致的腎上腺增大。無菌動物的特征主要反映在下面兩個方面：
（一） 形態學改變
1. 消化系統
主要變化在腸道。
（1） 無菌動物腸道肌層薄，更為特異的是盲腸肥大，比普通動物要大5～6倍。無菌豚鼠的盲腸可達體重的1/3。主要是由于腸壁薄、張力低而增大。由于盲腸膨大，腸壁菲薄，常因盲腸扭轉或腸壁破裂而死亡。如給無菌動物注入梭狀芽孢桿菌則可縮小盲腸體積。
（2） 腸黏膜絨毛增多。
（3） 肝臟重量下降。
2. 循環系統
心臟相對縮小。
3. 血液系統
白細胞增加。普通動物白細胞總數波動范圍大，無菌動物白細胞數值恒定。
4. 單核-巨噬細胞系統
脾臟縮小，無三級濾泡，單核-巨噬細胞功能降低。
（二） 生理學改變
1. 免疫功能
由于單核-巨噬細胞系統、淋巴組織發育不良，淋巴小結內缺乏生發中心，產生丙種球蛋白的能力很弱（在檢查無菌動物的無菌性時，血清丙種球蛋白陰性可以作為無菌的一個輔助證據），又因為體內無微生物和寄生蟲，血中無抗體，血清殺菌力低，吞噬細胞噬菌力也低，因此對微生物感染異常敏感，某些病原性弱和必須經腹腔或顱腦接種才能感染普通動物的微生物很容易感染無菌動物。
2. 生長率
無菌條件下對不同種屬影響不同。無菌鳥類生長率高于同種的普通鳥類；無菌大小鼠與普通鼠差不多；無菌豚鼠和無菌兔生長率比普通者慢。這是因為因腸內無菌，不能幫助消化纖維素以提供機體所需要的營養。
3. 生殖
無菌條件對動物的生殖影響不大。無菌大鼠和小鼠的繁殖率高于普通動物；無菌豚鼠及兔比普通者繁殖力低，可能因大盲腸之故。
4. 代謝
血中含氮量少，腸管對水的吸收率低，代謝周期比普通動物長。
5. 營養
無菌動物腸道上皮細胞更新率比一般動物低，腸壁的物質交換也較慢。無菌條件下的各種動物通過膽汁排泄代謝產物的速率均減慢；如切除無菌動物的盲腸，則無菌動物與普通動物的差異縮小。關于盲腸增大的原因，曾進行過許多研究，尚無明確結果。推測可能是因為飼料中的有毒物質刺激盲腸，使其增大加長、彈性減少。正常情況下飼料中的毒性物質可被腸道菌分解。無菌條件對兔及豚鼠的盲腸產生的影響最大，Sabourdy曾稱量過無菌豚鼠的盲腸（連同腸內容物），結果盲腸相當于豚鼠體重的1/3。
6. 壽命
無菌大鼠和小鼠比普通者長壽。
三、無菌動物技術
無菌動物在自然界并不存在，必須用人為的方法養育而成。無菌動物的理論基礎和實踐依據在于胎盤屏障和屏障觀念。實施過程有以下幾個環節：
1. 在無菌條件下取仔
培育胎生動物如哺乳類，要用無菌的剖宮產手術，將已成熟的胎兒從無菌的子宮內取出，通過滅菌液浸泡槽輸入無菌隔離器內，用人工配制的初乳飼喂。培育無菌卵生動物，如禽類，要從微生物傳染病最少的健康動物群中，選擇未被糞便污染的受過精的蛋，并將蛋的表面徹底滅菌后送入無菌隔離器內孵化育雛。
2. 無菌動物的飼料和飼育裝置
飼養無菌動物的環境必須是絕對沒有微生物以及其他可能感染動物的生物。根據這個要求，美國賴尼瑟在1943年用金屬材料制成能耐受高壓蒸氣滅菌的隔離器，隔離器上有玻璃觀察窗和操作橡皮手套，他用這種隔離器飼養出了無菌雞。1959年特雷克斯勒使用無毒塑料薄膜制成無菌隔離器的主體部分。這種隔離器制造工藝較為簡單，易于觀察操作，造價僅為金屬制的幾十分之一，滅菌簡便。
人工乳的營養成分和飼喂技術，是無菌動物飼養成功的關鍵。離乳后喂給滅菌的飼料和飲水。輸入無菌隔離器的空氣要經過0.3微米的濾除率達99.97%以上的高效濾過器，排氣口亦同樣裝有高效濾過器，以免空氣逆流時帶入細菌。飼料、飲水和墊料都要經過真空高壓或鈷60照射滅菌后輸入器內。
3. 無菌動物的檢查
對無菌動物要定期檢查，以確保無菌狀態。一般每兩周檢查一次，發現污染立即淘汰。
四、悉生動物的飼養管理
悉生動物和無菌動物一樣，均飼養在無菌隔離器中，飼養管理方法也與無菌動物相同。無菌動物由于腸道里沒有細菌，所以不能在腸內合成機體所需要的某些維生素和氨基酸，而必須由日常的飼料中補給。無菌動物飼養管理困難，且生活能力較差。把對機體有益的若干種腸道細菌喂給無菌動物，使之在腸道內定居，這就成為悉生動物。它遠較無菌動物的生活能力強。飼養管理也比較容易，在多種研究試驗中，可以代替無菌動物。
悉生生物因為無微生物的刺激，其淋巴系統發育不全，體液和細胞防御系統不如普通動物；淋巴漿細胞少，脾較小，白細胞缺乏和吞噬反應差，血清殺菌活性差，球蛋白含量低，很少含有抗細菌的凝集素，因而無菌動物易于感染疾病。
【小結】
常規涂片及培養技術是研究細菌的傳統方法，其中厭氧培養技術對正常菌群的研究尤其重要。分子生物學技術如核酸擴增、電泳、探針雜交等成為目前研究正常菌群的主要手段之一，應用16S rRNA作為研究對象，采用以PCR為基礎的多種分子生物學分析手段的聯合應用，可以快速、微量、準確地對正常微生物進行檢測，不僅可以對腸道細菌組成及數量進行測定，還能對細菌的活性進行分析。宏基因組技術是以測序為基礎的研究微生物所有基因（基因組）的方法，主要的研究手段是第二代高通量測序和生物信息分析，宏基因組學技術在正常菌群的研究方面具有獨特的優勢，目前已經取得了一些突破性的結果。菌群代謝產物檢測技術有許多種方法，采用何種技術主要取決于待分析物的種類以及研究的目的。代謝組學則是通過以上各種技術定量分析一個生物系統內所有代謝物的含量，從而為更直接地揭示正常菌群與人體健康和疾病的關系提供了新的途徑。無菌動物與悉生動物為我們研究正常菌群對宿主的影響提供了非常好的模型，能夠使我們更加全面地宏觀地研究正常菌群對宿主的生理作用。
（馬卓婭 鄭躍杰）