快速溶劑萃取法優化胡黃連提取工藝

李存滿，楊曉華，王文淑

（河北科技大學河北省分析測試研究中心，石家莊 050018）

胡黃連系玄參科胡黃連屬植物的干燥根莖，為常用中藥。目前，已經從胡黃連中分離得到70多種化合物，主要含有環烯醚萜苷、苯乙醇苷、酚苷、葫蘆烷型三萜苷等類成分^[1]。其主要活性成分環烯醚萜苷類^[2]，以胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ和胡黃連苷Ⅲ為主。由于胡黃連苷Ⅲ對照品不易得，而其結構中含有阿魏酰基，水解產物得阿魏酸，因此，我們以阿魏酸含量為指標間接考察胡黃連苷Ⅲ的提取工藝。

文獻報道，胡黃連藥材的提取方法多是以傳統的浸泡、滲漉^[3]、加熱回流^[4-6]，一般以胡黃連苷Ⅰ^[6]和胡黃連苷Ⅱ^[3,5]轉移率為評價指標，利用高效液相色譜法^[3,5]、薄層色譜掃描法^[6]進行測定。但這兩種提取方法的最大缺陷是耗時長。快速溶劑萃取（ASE）是一種在高溫高壓下萃取樣品中有機成分的新方法，具有有機溶劑用量少、自動化程度高、萃取效率高、可以大大縮短樣品的提取時間等特點，已被確認為美國EPA標準方法（編號3545）^[7,8]。

本文利用快速溶劑萃取法對胡黃連藥材進行提取，采用L₉(3⁴)正交試驗，以胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ及阿魏酸含量為評價指標，利用高效液相色譜法對胡黃連藥材的提取工藝進行優化。

1　實驗部分

1.1　儀器

高效液相色譜儀（alliance e2695，美國Waters公司）配置二極管陣列檢測器；快速溶劑自動萃取儀（AES300，美國Donex公司）。

1.2　試劑與材料

試劑：乙腈、甲酸（色譜純，美國Fisher公司），純水（由美國Milipore 純水系統制備），其他試劑為分析純。

胡黃連藥材（購自石家莊市神威大藥房），胡黃連苷Ⅰ對照品（批號11062102，購自中國藥品生物制品檢定所），胡黃連苷Ⅱ對照品（批號12031501，購自中國藥品生物制品檢定所），阿魏酸（110773-201012，購自中國食品藥品檢定研究院）。

2　實驗方法

2.1　色譜條件

色譜柱：SunFire^TM C18 (250mm × 4.6mm, 5μm)；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；洗脫梯度：0→10min，5%→15% A；10→20min，15%→25% A；20→35min，25%→25% A；25→35min，25%→28% A；35→40min，28%→35% A；40→45min，35%→75% A；45→50min，75%→95% A；50→55min，95%→95% A；流速1.0ml/min；柱溫30℃；檢測波長264nm；進樣量10μl。

2.2　不同提取方法

2.2.1　加熱回流提取

精密稱取胡黃連樣品，約0.1g，置于50ml蒸餾瓶中，加熱回流提取2次，每次加入30%（體積分數）乙醇溶液20ml，提取1h，過濾，合并兩次濾液于100ml容量瓶中，并用30 %乙醇定容至刻度，搖勻，過0.45μm濾膜，濾液作為供試品溶液。

2.2.2　超聲提取法

精密稱取胡黃連樣品約0.1g，置于三角瓶中，超聲提取2次，每次加入30 %乙醇溶液20ml，提取時間30min，提取功率500W。過濾，合并兩次提取液于100ml容量瓶中，搖勻，經0.45μm濾膜過濾，濾液作為超聲提取供試品溶液。

2.2.3 ASE法

精密稱取胡黃連樣品0.1g左右，放入儀器樣品池中，提取溶劑為30%乙醇，提取時間設置為5min，提取溫度60℃，提取兩次，合并兩次提取液并用30 %乙醇定容至100ml，搖勻，經0.45μm濾膜過濾，濾液作為ASE法供試品溶液。

2.3　胡黃連供試品溶液的制備

稱取胡黃連藥材粉末約0.1g，精密稱定，用快速萃取儀提取，萃取溶劑為50%（體積分數）乙醇溶液，萃取壓力為1500psi（約10.3MPa），萃取溫度為80℃，萃取時間為5min，循環萃取2次。提取液合并，減壓濃縮，然后用乙醇定容到100ml，搖勻，該溶液作為胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ供試品溶液。從上述供試品溶液精密移取50ml溶液于燒瓶中，減壓濃縮，至乙醇干，殘渣用2% NaOH溶液溶解，于水浴上回流3h，放冷。分解液移入分液漏斗中，用濃鹽酸調pH=3～4，用乙醚萃取3次，每次30ml，合并乙醚液，減壓濃縮至干，殘渣用甲醇-水（1 : 1）溶解，并定容至10ml，該溶液作為阿魏酸供試品溶液。

2.4　標準工作溶液的配制

精密稱取胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ和阿魏酸對照品各10mg于10ml容量瓶中，用30%乙腈溶解并定容，配制成濃度均為1.0mg/ml的標準儲備液。將標準儲備液配制成混合標準溶液后，再用30 %乙腈將胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ稀釋成濃度（μg/ml）均分別為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、200.0，阿魏酸儲備液稀釋成濃度（μg/ml）為3.0、6.0、12.0、24.0、48.0、120.0的混合標準工作溶液。

2.5　正交試驗設計

本實驗選用正交試驗法，采用L₉(3⁴)正交設計表分別以胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、阿魏酸含量為考察指標，對提取溶液濃度，提取次數，提取時間，提取溫度4個因素進行考察，每個因素選取3 水平（表1），采用正交試驗評價指標優選其最佳提取工藝。綜合評分各指標權重見表2。

3　結果與討論

3.1　提取方法選擇

本實驗以胡黃連中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、阿魏酸含量為考察指標，對加熱回流提取法，超聲波提取法，ASE法三種提取方法進行比較。結果發現，ASE法提取效率明顯高于前兩種方法，且該方法提取時間大大縮短，提取過程僅約20min即完成。因此，本實驗采用ASE法作為胡黃連藥材的提取方法。

3.2　提取條件優化

3.2.1　正交實驗分析結果

分別準確稱取胡黃連樣品9份，每份約0.1g，按表1正交試驗設計進行提取，分別以胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ和阿魏酸含量為評價指標，考察各因素對胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ和阿魏酸提取效率的影響，從而篩選出最佳提取工藝。測定結果見表3，方差分析結果見表4。

3.2.2　正交實驗結果分析

方差分析和直觀分析結果表明，以胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ和阿魏酸含量的綜合評分作為考察指標，最佳提取條件為A₂B₂C₁D₃，各因素作用主次為B＞A＞D＞C。因此，得到最佳提取條件為：提取濃度為50%乙醇，提取2次，提取溫度為80℃，提取時間為5min。

3.2.3　最佳條件驗證實驗

為了驗證最佳提取條件，選用平行試驗法，做兩組平行試驗。

驗證供試品溶液的制備：分別稱取胡黃連樣品約0.1g，按上述最佳提取條件，按2.3操作制備得胡黃連供試品溶液。在2.1色譜條件下，進行測定。結果見表5。

分別以胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、阿魏酸含量為考察指標，在最佳提取條件下，驗證供試品中三指標含量均大于正交實驗條件下的測得的樣品含量，因此，此條件即為最佳提取條件。

4　結論

ASE法提取時間短，穩定、可行，提取效率高，可作為胡黃連的提取工藝。

參考文獻

[1] 韓華, 殷鑫, 張天宇, 等. 中醫藥學報, 2014, 42(2): 94-96.

[2] 楊潔, 李萍, 張玉萌, 等. 解放軍藥學學報, 2003, 19(3): 217- 218, 240.

[3] 侯文彬, 周福軍, 單淇, 等. 天津中醫藥大學學報, 2013, 32(3): 154-156.

[4] 李雪春, 楊曉寧, 李善茂. 世界中醫藥, 2011, 6(2): 168-170.

[5] 段曉穎, 高衛芳, 吳彩麗, 等. 中國藥房, 2011, 22(39): 3675-3676.

[6] 孟琳, 鄭雪凌, 田景振. 中國生化藥物雜志, 2012, 33(3): 280-282.

[7] 曹靜亞, 譚亮, 遲曉峰, 等. 中藥材, 2013, 36(7): 1168-1171.

[8] 曹靜亞, 遲曉峰, 陳濤, 等. 天然產物研究與開發, 2014, 26: 136-141.