氣相色譜測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸的條件優(yōu)化

張曉清，楊志巖，降升平

（天津科技大學(xué)現(xiàn)代分析技術(shù)研究中心，天津 300457）

揮發(fā)性脂肪酸（VFA）是指小分子有機(jī)脂肪酸，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、正丁酸等，具有較強(qiáng)的揮發(fā)性。厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物主要有乙醇、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等，在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，VFA濃度及各種酸含量變化可以間接反映出厭氧發(fā)酵進(jìn)程^[1]。因此靈敏、快速地測(cè)定VFA濃度及各種酸濃度是控制厭氧發(fā)酵進(jìn)程的有效方式。另外，氣相色譜快速、靈敏地測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸在畜牧業(yè)^[2]及葡萄酒制造^[3]都有重要應(yīng)用。

目前，測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸的方法主要有紙色譜法、比色法、滴定法、柱色譜法以及氣相色譜法等^[4]。其中，氣相色譜法能夠快速、靈敏的分析揮發(fā)性脂肪酸總量且能得到各酸含量，因此有較廣泛應(yīng)用^[5-7]。本研究利用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交分析試驗(yàn)對(duì)氣相色譜測(cè)定主要影響因素和條件進(jìn)行優(yōu)化，并以分離度和峰面積為指標(biāo)量化評(píng)價(jià)，分析主要影響因素的影響規(guī)律，最終得到快速、準(zhǔn)確的氣相色譜操作條件，為實(shí)際應(yīng)用提供可行的試驗(yàn)方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器與試劑

儀器：氣相色譜儀（GC9560）上海華愛(ài)色譜，F(xiàn)FAP毛細(xì)管色譜柱（30m×0.32mm×0.5μm），氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）。

試劑：甲酸（分析純）相對(duì)密度1.22，含量88%。

混合酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：乙醇（優(yōu)級(jí)純）3.55g/L、乙酸（分析純）3.56g/L、丙酸（分析純）3.72g/L、丁酸（分析純）3.5g/L、異丁酸（分析純）3.43g/L、異戊酸（分析純）3.50g/L。

混合酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：取10ml混合酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與100ml容量瓶中，加入5ml甲酸，最后用超純水定容。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1　評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定方法

通過(guò)文獻(xiàn)[8]可知分離度既能反映柱效能，又可以反映柱選擇的總分離效能。分離度指相鄰兩組分色譜峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。根據(jù)公式（1）計(jì)算：

　　（1)

式中：為第n個(gè)峰的保留時(shí)間，min；W_n為第n個(gè)峰的峰寬，min；R_n為第n個(gè)峰的分離度。

R_n值愈大，表明兩組分分離的愈完全。通常用R_n≥1.5說(shuō)明兩峰得到完全分離，R_n=1.5時(shí)，分離程度可達(dá)99.7%，表明相鄰兩組分已完全分離。研究中，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丙酸和異丁酸兩者色譜峰比其他幾種酸更難分離。因此，選擇丙酸和異丁酸的分離度作為試驗(yàn)的分離度評(píng)價(jià)指標(biāo)。

峰面積A用于組分的定量分析，可以直接反映試驗(yàn)的靈敏度，本研究以6種組分峰面積之和作為衡量指標(biāo)。

1.2.2　單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)文獻(xiàn)[4,9]及預(yù)試驗(yàn)確定試驗(yàn)初始條件：分流比（30 : 1）、進(jìn)樣器溫度250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度230℃、氫氣壓力60kPa、空氣壓力50kPa、尾吹氣流量（30ml/min）、載氣流量70ml/min、柱溫190℃、進(jìn)樣量1μl。本研究在初始條件的基礎(chǔ)上對(duì)柱溫、載氣流量、進(jìn)樣器溫度和進(jìn)樣量依次進(jìn)行單因素分析。

1.2.3　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)確定的最佳色譜條件的基礎(chǔ)上，選擇單因素試驗(yàn)結(jié)果較好的3個(gè)條件為正交試驗(yàn)條件，以峰面積和分離度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)氣相色譜測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸的條件進(jìn)行優(yōu)化。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素結(jié)果分析

2.1.1　柱溫試驗(yàn)分析

柱溫是氣相色譜主要的影響因素，其條件的確定根據(jù)所測(cè)組分復(fù)雜程度及組分的汽化溫度決定，使用毛細(xì)管柱分析多組分時(shí)一般采用程序升溫。在多次試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)置5種柱溫條件：（a）恒溫190℃；（b）程序升溫，初始溫度130℃（停留1min），以10℃/min升至190℃（停留1min）；（c）程序升溫，初始溫度100℃（停留2min），以6℃/min升至190℃；（d）程序升溫，初始100℃（停留2min），以10℃/min升至190℃（停留1min）；（e）程序升溫，初始溫度100℃（停留2min），以6℃/min升至130℃（1min），再以10℃/min升至190℃（停留2min）。考察5種柱溫條件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。繪制相關(guān)圖表時(shí)柱溫以a～e表示。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在條件a（恒溫）下分離度及總面積值最低，色譜圖中各酸未得到較好的分離且峰形較差；這表明恒溫下不適用于毛細(xì)管色譜柱測(cè)定VFA。條件b與條件d的結(jié)果說(shuō)明，不同的起始溫度對(duì)分離度及靈敏度有影響。條件d與條件e的結(jié)果相比，不同的升溫速率在測(cè)定VFA時(shí)，在分析速度、分離度及靈敏度都有較大的影響。條件e采用分段升溫，分離度及總面積達(dá)到最大值。因此，條件以e作為單因素試驗(yàn)的最佳條件，并將條件c、d、e進(jìn)行正交分析試驗(yàn)。

2.1.2　載氣流量試驗(yàn)分析

載氣流量作為氣相色譜的重要參數(shù)，它對(duì)組分的保留時(shí)間（即分析效率）有重要影響。本試驗(yàn)參考所用儀器的常用載氣流量，選取了50ml/min、60ml/min、75ml/min及90ml/min作為試驗(yàn)條件，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

根據(jù)圖2可知，總峰面積及分離度隨著載氣流量的增加而增加，在載氣流量達(dá)到75ml/min時(shí)達(dá)到最大值，已經(jīng)達(dá)到完全分離，靈敏度較高。當(dāng)繼續(xù)增加載氣流量時(shí)，檢測(cè)效果反而下降。由于載氣流量對(duì)峰寬影響較大，過(guò)低的載氣流量使峰寬展寬，造成峰拖尾。過(guò)高的載氣流量是組分流失，影響測(cè)定的靈敏性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇75ml/min作為下面單因素試驗(yàn)條件，并選擇60ml/min、75ml/min、90ml/min作為正交分析條件。

2.1.3　進(jìn)樣器溫度試驗(yàn)分析

進(jìn)樣器溫度設(shè)置依據(jù)待測(cè)組分的揮發(fā)性、沸點(diǎn)及穩(wěn)定性，能夠保證待測(cè)組分完全汽化而又不發(fā)生分解。進(jìn)樣器溫度一般高于待測(cè)組分的沸點(diǎn)。VFA中最高沸點(diǎn)在180～190℃，因此，本試驗(yàn)中選定200℃、220℃、230℃和250℃作為單因素試驗(yàn)條件，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，各溫度的峰面積基本沒(méi)有變化，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5%。因此進(jìn)樣口溫度對(duì)峰面積影響較小，可以不予考慮。分離度呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，在200℃和220℃時(shí)分離度R_n>1.5表明可以完全分離，因此選擇200℃作為單因素試驗(yàn)的最佳條件。選擇200℃、220℃及250℃作為正交分析的實(shí)驗(yàn)條件。

2.1.4　進(jìn)樣量試驗(yàn)分析

進(jìn)樣量的多少直接影響到檢測(cè)的靈敏性，進(jìn)樣量過(guò)大容易色譜柱超載。液體進(jìn)樣在 0.5μl～2μl^[10]。試驗(yàn)選取0.5、1、1.5及2μl作為單因素試驗(yàn)條件，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，進(jìn)樣量大于1.5μl時(shí)，峰面積的增長(zhǎng)趨勢(shì)緩；小于1.5μl時(shí)，隨著進(jìn)樣量的增加，峰面積的增長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致；分離度隨著進(jìn)樣量的增加呈下降趨勢(shì)。在進(jìn)樣量為1.5μl和2μl時(shí)，乙醇的色譜峰產(chǎn)生拖尾。因此，綜合考慮選擇1μl為單因素分析的最佳條件，并選擇0.5μl、1μl及1.5μl作為正交試驗(yàn)條件。

2.2　正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

以單因素試驗(yàn)確定的正交條件設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，正交水平如表1所示：

利用極差分析法對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析如表2所示。在分離度檢測(cè)結(jié)果方面，VFA氣相色譜檢測(cè)的最優(yōu)化條件是A3B3C2D2，即進(jìn)樣量1.5μl、柱溫條件d、載氣流量75ml/min和進(jìn)樣口溫度220℃。比較4個(gè)因素得到的R值可知，進(jìn)樣口溫度和柱溫對(duì)分離度的影響較大，其他兩個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響較小。

在峰面積上，4個(gè)因素對(duì)VFA檢測(cè)結(jié)果影響的主次順序?yàn)椋哼M(jìn)樣量>進(jìn)樣口溫度>柱溫>載氣流量。最佳的優(yōu)化條件為：進(jìn)樣量1.5μl、柱溫條件e、載氣流量為70ml/min、進(jìn)樣口溫度250℃。

比較分離度及峰面積的最佳試驗(yàn)條件：在進(jìn)樣量為1.5μl下，其分離度為2.60>1.5，所以VFA的色譜峰可以完全分離。對(duì)于柱溫條件，條件d和條件e下分離度為2.57、3.53，在兩個(gè)條件下均可以完全分離，而兩個(gè)條件下峰面積相差較大，所以綜合考慮采用柱溫條件e作為最佳試驗(yàn)條件。載氣流量在70ml/min和75ml/min，從表2可知，各影響條件下，分離度都可達(dá)到完全分離，峰面積相差較小。而在70ml/min下，色譜峰峰形發(fā)生拖尾且保留時(shí)間延長(zhǎng)，因此選用載氣流量為75ml/min作為最佳載氣流量條件。綜合考慮各因素，確定氣相色譜測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸的最佳條件為：進(jìn)樣量1.5μl、載氣流量75ml/min、柱溫條件為程序升溫：初始溫度100℃（停留2min）以6℃/min升至130℃（1min），再以10℃/min升至190℃（停留2min）、進(jìn)樣口溫度220℃。

2.3　優(yōu)化條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交優(yōu)化試驗(yàn)中得到的最佳氣相色譜條件下，對(duì)VFA進(jìn)行測(cè)定以驗(yàn)證條件的可行性。氣相色譜圖如圖5所示。從圖5可以看出，6種物質(zhì)的峰形對(duì)稱性較好，能夠完全分離；乙醇的色譜峰沒(méi)有產(chǎn)生嚴(yán)重拖尾。分析時(shí)間在10min之內(nèi)，比已有報(bào)道^[11,12]的分析時(shí)間大大縮短。

2.4　精密度試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的條件進(jìn)行精密度試驗(yàn)，對(duì)同一VFA樣品測(cè)定7次，分析結(jié)果如表3所示。在7次重復(fù)試驗(yàn)測(cè)定中VFA中各酸相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%。在正交試驗(yàn)選定的氣相色譜條件下各物質(zhì)能夠較好地分離，測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性好，精密度高。

在優(yōu)化最佳條件下，對(duì)不同濃度下的VFA樣品進(jìn)行測(cè)定，并繪制VFA標(biāo)準(zhǔn)曲線。取標(biāo)準(zhǔn)混合液0.5ml、1ml、3ml、5ml、7ml和10ml，加入5ml甲酸酸化后用超純水稀釋到100ml后進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)標(biāo)樣測(cè)定3次取平均值做VFA標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表4所示；標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。

從表4及圖6中可以看出測(cè)定VFA時(shí)，各曲線的相關(guān)系數(shù)都大于0.99，曲線的擬合度較高，測(cè)定結(jié)果精確。在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VFA中各酸的濃度與峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)建立了利用FFAP毛細(xì)管柱氣相色譜檢測(cè)VFA定性及定量的方法。采用了單因素分析結(jié)合正交試驗(yàn)研究了柱溫、載氣流量、進(jìn)樣口溫度及進(jìn)樣量對(duì)氣相色譜測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸檢測(cè)結(jié)果的影響。試驗(yàn)以各酸測(cè)定的總面積及丙酸和異丁酸之間的分離度作為分析評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素確定的最佳條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)。通過(guò)極差分析得到了氣相色譜測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸的最佳條件為：進(jìn)樣量1.5μl；載氣流量75ml/min；柱溫條件：程序升溫［初始溫度100℃（停留2min）以6℃/min升至130℃（1min），再以10℃/min升至190℃（停留2min）］；進(jìn)樣口溫度220℃。最終檢驗(yàn)結(jié)果證明，揮發(fā)性脂肪酸中各組分能夠完全分離且峰形基本對(duì)稱。本研究所得到的試驗(yàn)條件可以用于氣相色譜測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸。該方法的確立為實(shí)際厭氧發(fā)酵等行業(yè)的應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

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作者簡(jiǎn)介：張曉清, 女, 高級(jí)實(shí)驗(yàn)師, Tel : 022-60912327, E-mail：zhangxiaoqing@tust.edu.cn