氣相色譜法測(cè)定睪酮凝膠中肉豆蔻酸異丙酯的含量

顏紅^1,2，徐偉娜^1,2，劉林^1,2，楊清華^1,2*

（1．山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101；
2．山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)公司，山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101）

睪酮凝膠是一種雄性激素，商品名ANDRGEL^?，由美國(guó)Unimed公司研發(fā)，現(xiàn)由ABBOTT PRODS生產(chǎn)，美國(guó)FDA于2000年2月28日批準(zhǔn)上市^[1]，主要用于治療男性內(nèi)源性睪酮激素分泌不足或者缺乏的替代治療。該制劑為無(wú)色透明均勻的水醇凝膠劑，均勻涂于兩肩、雙上臂或腹部，睪酮經(jīng)透皮吸收后，可使男性性腺功能低下的患者達(dá)到并維持血液中正常睪酮濃度^[2]。肉豆蔻酸異丙酯（IPM），又名十四酸異丙酯，是一種很重要的長(zhǎng)鏈羧酸酯類化合物^[3]，極易被皮膚吸收。是半固體基質(zhì)的組分之一，也可作為局部給藥制劑中許多物質(zhì)的溶劑，應(yīng)用于各種局部制劑和化妝品中^[4]。作為透皮吸收促滲劑，能顯著提高睪酮凝膠的經(jīng)皮透過(guò)速率^[1]。

藥物制劑中肉豆蔻酸異丙酯的含量測(cè)定方法鮮有報(bào)道。本文采用氣相色譜法，測(cè)定了自制睪酮凝膠中肉豆蔻酸異丙酯的含量。該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，簡(jiǎn)便可行。

1　儀器與試藥

Agilent 6890N氣相色譜儀包括氫焰離子化檢測(cè)器、HV-5空氣壓縮機(jī)、SPE-300氫氣發(fā)生器；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；肉豆蔻酸異丙酯對(duì)照品（梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：AGNO1 ）；棕櫚酸異丙酯（梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：GJ01-BHWJ）；睪酮凝膠（自制，批號(hào)為20141201、20141202、20141203）。

2　方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

色譜柱為 5%苯基-95%二甲基硅氧烷的毛細(xì)管柱（美國(guó)GS-TEK公司，GsBP-5，30m× 320μm×1.8μm），載氣為氮?dú)猓兌?9.999%，流速2.0ml/min，氫氣流速30ml/min，空氣流速300ml/min，柱溫220℃，檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)樣口溫度230℃，分流比為10 : 1，尾吹：25，進(jìn)樣量2μl。

2.2　溶液的制備

（1）對(duì)照品溶液的制備 精密稱取肉豆蔻酸異丙酯對(duì)照品125mg，置25ml量瓶中，以正己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取1ml置10ml量瓶中，以正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備 精密稱取睪酮凝膠2.5g（約相當(dāng)于肉豆蔻酸異丙酯12.5mg），置燒杯中，加正己烷適量，攪拌、超聲提取3次，提取液轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

（3）陰性對(duì)照品溶液的制備 按處方工藝制備不含肉豆蔻酸異丙酯的樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3　方法學(xué)研究

（1）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密稱取肉豆蔻酸異丙酯45mg和棕櫚酸異丙酯5mg，置于同一10ml量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。精密稱取肉豆蔻酸異丙酯125mg，置于25ml量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液2μl，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖（見(jiàn)圖1），結(jié)果顯示系統(tǒng)適應(yīng)性溶液中，肉豆蔻酸異丙酯峰與棕櫚酸異丙酯峰分離良好（分離度R≈18.9）。

（2）專屬性試驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各2μl，依法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾。

（3）線性與范圍 精密稱取肉豆蔻酸異丙酯125.5mg，置25ml量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml置于10ml量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液各2μl，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積A對(duì)濃度c進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=2186.1c +13.673；r=1，表明肉豆蔻酸異丙酯在0.1004～2.51mg/ml的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

（4）精密度試驗(yàn) 精密稱取肉豆蔻酸異丙酯適量，加正己烷溶解并稀釋制成0.7mg/ml的溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次2μl，記錄色譜峰圖及峰面積，結(jié)果肉豆蔻酸異丙酯峰面積的RSD為1.61%（n=6）。

（5）溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液及對(duì)照品溶液，分別于0、2h、4h、6h、8h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積。結(jié)果表明對(duì)照品溶液的RSD為1.76%，供試品溶液的RSD 1.16%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

（6）定量限 精密稱取肉豆蔻酸異丙酯適量，加正己烷溶解定量稀釋成不同倍數(shù)的系列溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得肉豆蔻酸異丙酯的定量限為0.16ng（S/N≈10）。

（7）回收率試驗(yàn)精密稱取處方量的80%、100%、120%的肉豆蔻酸異丙酯及相應(yīng)量空白基質(zhì)于燒杯中，攪拌均勻，各3份，共9份；分別加正己烷6ml，充分?jǐn)嚢瑁崛∪舛罐⑺岙惐ィ貜?fù)提取3次，提取液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密稱取肉豆蔻酸異丙酯對(duì)照品約125mg，置25ml量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，精密移1ml至10ml量瓶中，正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各2μL，注入氣相色譜儀，記錄譜圖及峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。測(cè)得平均回收率為98.96%，RSD為0.53%（n=9）。

2.4　樣品含量測(cè)定

取本品，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算供試品中肉豆蔻酸異丙酯的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3　討論

3.1　色譜條件的篩選

美國(guó)藥典（USP38）^[5]及英國(guó)藥典（BP2015）^[6]均收載了肉豆蔻酸異丙酯，均采用氣相色譜法測(cè)定了含量，但是色譜條件不同，見(jiàn)表3。

我們分別按USP38和BP2015方法，取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，按USP38和BP2015方法，采用程序升溫，肉豆蔻酸異丙酯峰與棕櫚酸異丙酯峰的分離度大于6.0。我們根據(jù)實(shí)際情況，采用等溫的方式，選擇使用柱效高、分離度好、檢測(cè)靈敏度高的毛細(xì)管柱，以氮?dú)鉃檩d氣。通過(guò)適當(dāng)調(diào)整載氣流速、檢測(cè)器溫度、進(jìn)樣口溫度以及柱溫等，使系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果符合測(cè)定要求（肉豆蔻酸異丙酯峰與棕櫚酸異丙酯峰的分離度不小于6.0），且空白基質(zhì)無(wú)干擾。表明采用等溫方式，同樣可以達(dá)到此要求，且節(jié)約分析時(shí)間，提高了試驗(yàn)效率。

3.2　提取次數(shù)的選擇

同一批號(hào)睪酮凝膠（批號(hào)20141201）按“2.2.2”項(xiàng)下方法除提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5次外，其他步驟平行操作，含量測(cè)得結(jié)果分別為0.43%、049%、0.51%、0.50%、051%。從測(cè)定結(jié)果可以看出，提取了兩次即能基本提取完全。綜合考慮試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可操作性，選擇提取次數(shù)為3次。

參考文獻(xiàn)

[1] 林佳亮, 曾凡波, 等. 中國(guó)藥師, 2005, 8(9): 757-758.

[2] 狄平平, 趙立平, 等. 中國(guó)臨床藥學(xué)雜志, 2009, 18(6): 354.

[3] 吳志平, 張治柳, 等. 中南林學(xué)院學(xué)報(bào), 2000, 12, 20(4): 72-75.

[4] [英]R.C.羅，[美]P.J.舍斯基等編, 藥用輔料手冊(cè)(原著第四版)[S]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 359.

[5] USP(38) [S].

[6] BP(2015) [S].

^*通信作者：楊清華，研究員，Tel：0531-88562281，E-mail: 632887840@qq.com