第二節　性成熟和促性腺激素對小鼠卵母細胞體外發育能力的影響

一、引言

伴隨我國毛紡工業、乳品加工業以及高檔餐飲業等產業的高端化發展，高檔原材料的供給已成為制約相關產業發展的瓶頸。目前，我國對一些重要經濟品種的需求十分迫切，如產毛直徑在17μm以下的超細毛羊、產奶量達12t以上的超高產奶牛，以及肉用價值極高的和牛、韓牛等，但這些品種資源均被相關國家視為“國寶”，并作為戰略資源加以保護，限制種質資源外流。目前國內已初步建立了相關經濟品種的種群，但數量極其有限。由于自然繁殖速度慢，采用人工授精、胚胎移植等常規擴繁技術，建立一個2000只的純種羊群，至少要10年。利用幼畜卵母細胞體外受精、胚胎移植能夠大大縮短世代間隔，盡管性成熟前動物卵母細胞體外成熟、受精后已經產生后代（Revel等，1995；O’Brien等，1997，Khatir等，1998a；Ptak等，1999），但性成熟前動物卵母細胞發育能力差，獲得的囊胚移植后獲得后代的比例比較低，胎兒死亡的原因不得而知（Seidel等，1971；Pinkert等，1989；Eppig等，1992；Revel等，1995；Damiani等，1996；Khatir等，1996；O’Brien等，1996；Izquierdo等，1999；Wu等，2007）。我們以小鼠為實驗模型從細胞和分子水平研究性成熟前后動物卵母細胞體外發育能力問題，并尋找改善卵母細胞發育能力的方法。

（一）卵母細胞的成熟

在討論卵母細胞發育能力前，先闡述卵母細胞的生成和成熟過程。對于小鼠來講，卵子生成始于第8天胚胎的原生殖細胞，之后從胚外中胚層遷移到后腸后部內胚層，胚胎生成的第12天，原生殖細胞遷移完全，到達生殖嵴，這時與周圍體細胞很快建立密切的關系，發育為卵原細胞。隨著一系列有絲分裂過程，大部分卵原細胞分化為初級卵母細胞，并進入第1次減數分裂前期，胚胎生成的第16天，幾乎所有的卵母細胞進入粗線期，第18天進入雙線期。分娩時，一些卵母細胞進入晚期雙線期，雙線期的卵母細胞在生長和分化過程中不斷地進行物質積累、核定位（Mitra and Schultz，1996）及細胞周期調控蛋白的翻譯和翻譯后修飾作用（de Vantery等，1996）。在不同動物，卵母細胞在這一時期休止數日至數年不等，出生5天后的小鼠，幾乎所有的卵母細胞均處于核網期。很快，這些卵母細胞被一層扁平上皮細胞包圍，成為原始卵泡。卵泡不斷生長，但卵母細胞仍處于GV期，一直到性成熟前。性成熟后，在體內排卵前促性腺激素峰的作用下開始恢復減數分裂，形成兩個一大一小單倍體細胞，經過類似間期的短暫停頓，不進行DNA合成，次級卵母細胞即進入第2次減數分裂。第2次成熟分裂后，由卵泡中釋放到輸卵管中并接受精子入卵，然后釋放第二極體。

卵母細胞成熟涉及到細胞核、細胞質、透明帶和卵丘細胞成熟的一個復雜的生理過程，核成熟是處于GV期的初級卵母細胞在MPF等多種因子與激素的作用下重新啟動減數分裂，經過GVBD、MⅠ期后，停滯于MⅡ期。細胞質發生的變化包括，RNAs及蛋白質合成，線粒體數量增加，并由近核區移向質膜下區，在一端出現大空泡，即帽狀線粒體，卵母細胞的皮質顆粒數量增加，到達MⅡ期時，CGs沿質膜下呈線狀排列，核糖體、內質網、營養性包涵物的數量都在增加；縫隙連接數量也增加，通過微絨毛連接與外周卵丘細胞聯系，分泌卵丘擴展因子；細胞核的成熟使卵母細胞能夠獲得減數分裂的能力，細胞質成熟是為卵母細胞激活、原核形成、附植前的胚胎發育做準備。細胞核和細胞質都成熟才能保證正常的受精和胚胎發育。

1.卵母細胞的體外成熟

成年動物每次發情周期，卵巢中約有500～1000個初級卵母細胞在促性腺激素或其他因子的作用下恢復減數分裂，發生生發泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD），排出第一極體，并發育到第2次減數分裂中期（MⅡ），成為成熟卵母細胞。成熟卵母細胞由極少數優勢卵泡發育而成，在卵泡發育過程中絕大部分卵泡閉鎖退化，到排卵時只有一個、幾個或十幾個（豬和犬等）。采用卵母細胞體外成熟技術，開發利用未成熟卵泡，成倍增加雌性動物遺傳資源的利用效率，也為其他胚胎工程技術研究和體外生產胚胎提供充足的卵母細胞。

卵母細胞在體內成熟時，卵泡內環境抑制卵母細胞的核成熟，使得核成熟和胞質成熟之間存在最佳平衡，使核質成熟同步化（Nogueira等，2003）；但在體外培養時，卵母細胞離開了卵泡的抑制環境，細胞核成熟的完成并不能保證細胞質的完全成熟。體外成熟卵母細胞獲得的胚胎經移植后，其胎兒出生率較體內成熟卵母細胞獲得的胎兒出生率低得多，自小腔卵泡中獲得的卵母細胞雖然已完成了細胞核成熟，即排出第一極體并發育到MⅡ期，但不能夠受精，即使受精后也很難發育到囊胚期；而大腔卵泡中的卵母細胞既能完成細胞核成熟，又能支持胚胎發育到囊胚階段（Eppig等，1994；Crozet等，1995）。這些現象可能與體外成熟的卵母細胞胞質成熟程度欠佳有關（Eppig等，1998）。近年來，人們應用多種方法改善卵母細胞體外細胞質成熟，包括卵丘細胞共培養（Ge Li等，2008），改善成熟培養液成分，如加入抑制卵母細胞核過早成熟的物質，使核質成熟同步化，加入生長因子、促性腺激素、能量物質，還有能夠促進卵母細胞GSH合成的半胱胺酸和胱氨酸等。

2.動物年齡對卵母細胞體外成熟的影響

同一種動物在不同年齡段其卵母細胞體外成熟的情況有所不同。雖然性成熟前動物有腔卵泡卵母細胞能夠恢復減數分裂，形成紡錘體，排出第一極體，到達第2次減數分裂中期的比例和成年動物沒有差別（O’Brien等，1996；Ledda等，1997；Wu等，2007），但細胞質成熟卻存在差異，具體表現在囊胚發育率降低、胚胎移植后胎兒存活率低（O’Brien等，1996；Ledda等，1997；Ptak等，1999）。例如，性成熟前山羊卵母細胞，盡管有高比例的核成熟率（72%），但得到的囊胚率卻很低（＜10%），這些都歸因于細胞質成熟異常和不完全。有報道表明，性成熟前動物卵母細胞代謝谷氨酸鹽和丙酮酸鹽速率比成年動物卵母細胞慢，卵母細胞體外成熟過程中mRNA、蛋白質合成、氨基酸吸收、能量代謝、MPF、MAPK活性都比成年動物低，卵丘細胞和卵母細胞之間縫隙連接數量少，卵母細胞周圍的卵丘細胞層數也影響卵母細胞成熟（譚景和等，1989）。性成熟前后卵母細胞直徑不同，幼年動物卵母細胞直徑小；體外成熟后，幼年動物卵母細胞皮質顆粒遷移不完全，多精受精的比例高（O’Brien等，1997；Luderer等，2001），最終導致卵母細胞發育能力差。

（二）影響卵母細胞體外發育的因素

卵母細胞發育能力是指卵母細胞成熟、受精后發育到胚胎特定時期的能力，隨著胚胎生物技術在家畜繁育和人類輔助生殖領域的應用，人們對卵母細胞發育能力給予了廣泛的關注。本書主要研究卵母細胞經體外受精后發育到早期囊胚的能力。許多報道表明卵泡、卵母細胞大小，卵母細胞的超微結構，卵母細胞周圍的卵丘細胞數，卵母細胞所在的卵泡微環境，卵母細胞蛋白和RNA合成，體外成熟培養系統，對卵母細胞發育能力都有影響。因此本書就這些方面研究性成熟前后卵母細胞體外發育能力之間的差別，并尋找改善發育能力的方法。

1.動物年齡對卵母細胞發育能力的影響

初情期是雌性動物初次發情和排卵的時期，是性成熟的初級階段，是具有繁殖能力的開始。初情期以前，雌性動物的生殖道和卵巢增長緩慢。隨著雌性動物年齡的增長逐漸，當達到一定年齡和體重時，即出現第1次發情和排卵。在初情期前，卵巢也有生長卵泡，但后來退化閉鎖而消失，新的生長卵泡又再出現，最后又再退化，如此反復進行，直到初情期開始，卵泡才能生長成熟以至排卵。性的成熟是一個過程，概念上與初情期有所不同，但有時兩者混用。可以把“性成熟”理解為生殖機能發育的某一特定時期，它是在初情期后的較晚時候，亦即生殖機能達到了比較成熟的階段。此時生殖器官已發育完全，具備了正常的繁殖能力。但此時身體的生長發育尚未完成，故一般種畜不宜配種，以免影響雌性動物本身和胎兒的生長發育。利用幼畜體外成熟卵母細胞能夠最大限度地縮短世代間隔，加速品種改良。然而，性成熟前動物卵母細胞發育能力比成年動物差在多種動物中都得到了證明（cattle：Revel F，1995；Damiani P，M R D，1995；Khatir H，M R D，1996；sheep：O’Brien J K，1996；Ledda S，1997；pig：Pinkert C A，J Reprod Fertil，1989；goat：Izquierdo D，Theriogenology，1999）。但也有一些研究認為和成年動物卵母細胞發育能力沒有差別（Armstrong D T，1992；Irvin B，1993）。性成熟前牛和綿羊卵母細胞作為供體已經出生了后代（Revel等，1995；O’Brien等，1997；Khatir等，1998a；Ptak等，1999）。然而，體外成熟的性成熟前牛（Revel等，1995）、山羊（Martino等，1995）、豬（Pinkert等，1989）、綿羊（Ledda等，1997）卵母細胞發育能力都低于成年動物。Eppig and Schroeder（1987）證明，卵母細胞發育能力隨著日齡的增加而增強。

2.促性腺激素對卵母細胞發育能力的影響

卵母細胞所在的卵泡環境直接影響體外成熟卵母細胞的發育能力，所以多年來人們一直探索如何操縱卵泡發育以提高卵母細胞的發育能力。在卵泡發育過程中，促性腺激素發揮了關鍵的作用。所以最常用的方法就是在收集卵母細胞前用促性腺激素處理卵巢，通過調節卵泡發育調節體外成熟卵母細胞的發育能力。然而，促性腺激素對卵母細胞發育能力的影響還存在爭議，不同實驗室得到的結果不盡相同。激素處理能夠提高性成熟前卵母細胞發育能力在多種動物上得到了證明（mouse：Eppig J J等，1994；rat：Zhang等，1989；sheep：Pugh等，1991；cow：Lu等，1991；Grazyna Ptak等，2003），也有一些人認為激素處理沒有作用。一些研究認為，激素能提高卵母細胞發育能力（Armstrong等，1991），一些研究認為會降低卵母細胞發育能力（Moor等，1985）。促性腺激素能夠引起卵泡顆粒細胞增殖，誘導LHR的合成和類固醇生成酶的表達，調節卵泡內的激素微環境。促性腺激素提高卵母細胞發育能力，是通過產生的一些因子通過細胞-細胞偶聯途徑導致卵母細胞的生理變化。促性腺激素受體在卵泡細胞中表達，因此，激素作用于卵泡細胞誘導信號，通過縫隙連接傳遞給卵母細胞，也有人證明激素能夠直接作用于卵母細胞，因為在倉鼠的卵母細胞上發現了促性腺激素受體。Wang等（1997）對促排卵和未促排卵的IVM卵母細胞進行比較發現，應用促排卵周期患者的獲卵率和達到第2次減數分裂中期（MⅡ期）卵母細胞的數量，明顯高于未應用促排卵周期的患者。超排獲得的卵母細胞與自然周期獲得的卵母細胞在發育能力上存在差異（Bing等，2002）。

注射FSH可以通過抑制顆粒細胞凋亡來挽救自然周期卵巢卵泡發生期間將要發生閉鎖的卵泡（Fukushima等，1985；王海濱等，2000）。FSH暫時抑制GVBD，改變第一次成熟分裂所需的時間，促進卵母細胞的成熟。FSH經常與LH協同使用。FSH促進卵丘細胞分泌E2，而E2又可直接作用于卵母細胞（有E2受體）（Fukushima等，1985），調節卵母細胞成熟和鈣離子儲存。還可能通過提高卵母細胞內在質量直接提高卵母細胞的發育能力。激素處理后SN卵母細胞的比例顯著提高。小鼠卵母細胞生長通常在卵泡腔形成時結束，卵母細胞由轉錄活躍狀態轉變為轉錄靜止狀態，染色質也有彌散，非環繞核仁構型（NSN）轉變為致密、環繞型核仁（SN）（Mattioli等，1988）。研究證實，這種轉變與卵母細胞獲得發育能力密切相關。SN構型卵母細胞的GVBD和成熟至MⅡ期的能力都明顯高于NSN型卵母細胞，成熟受精后SN卵母細胞能發育到囊胚，但是NSN型卵母細胞發育則很少能超過2-細胞（Zuelke，1997）。Vandenhyden等（1990）研究表明FSH可以延緩卵母細胞核成熟，使細胞質成熟完全。卵母細胞細胞核與細胞質成熟是相互獨立的過程，但是兩者需要保持同步才能保證卵母細胞較高的發育能力。

促性腺激素對性成熟前動物卵母細胞發育能力的影響已經有了一些研究。性成熟前動物處理促性腺激素后卵泡得到了生長，改善了卵母細胞發育能力。O’Brien等（1996）的實驗表明，注射促性腺激素的4～6月齡的性成熟前小羊，細胞質中線粒體和皮質顆粒的數量增加。Wu等（2007）的研究表明，性成熟前后小鼠卵母細胞發育能力有差別，注射促性腺激素后改善了性成熟前后卵母細胞發育能力，囊胚發育率幼鼠和成年鼠沒有差別。Tsafriri等的結果證明，FSH處理的性成熟前后卵母細胞核成熟比例和精子穿透比例沒有差別，但是成年山羊卵母細胞比性成熟前山羊卵母細胞的正常受精比例高（49% vs.24%）。然而，這一結論是由于FSH激素引起的還是由于供體年齡引起的未作研究。另外，Ledda等（1997），O’Brien等，（1997）表明注射促性腺激素的性成熟前羊卵母細胞發育能力低于成年羊，而Earl等的結論與之相反，加入促性腺激素處理的山羊顆粒細胞對性成熟前卵母細胞發育能力有促進作用，顆粒細胞作為營養物質產生一些信號，促進卵母細胞細胞質成熟。激素處理的山羊卵泡大，大直徑卵泡卵母細胞發育能力好于小卵泡，因此來源于大卵泡的顆粒細胞培養的卵母細胞發育能力好于小卵泡。

另有一些研究認為胚胎早期發育所需的mRNA及蛋白需要卵母細胞積累，由于激素刺激使排卵過早，卵母細胞內mRNA及蛋白水平必然受到影響。超排激素的使用可能導致卵巢過度刺激以及卵母細胞染色體的畸形。人類正常生理周期排出的卵母細胞與超排獲得的卵母細胞在基因及蛋白水平上存在差異。另有報道表明，與自然周期的小鼠比較，超排鼠體內囊胚表明微絨毛少，［³⁵S］-蛋氨酸吸收低，細胞數少。

這些研究結論存在一些矛盾可能是因為選擇動物的供體年齡、繁殖季節、飼養管理和激素處理方法不同。處理促性腺激素增加了性成熟前動物大的有腔卵泡的數量，增加了卵母細胞的數量，為胚胎體外生產提供了來源。因此，我們需要進一步了解性成熟前動物卵母細胞成熟機制，優化培養條件和促性腺激素的處理方法，提高這些卵母細胞的發育能力。

3.多精子受精對卵母細胞發育能力的影響

卵母細胞受精后，精子細胞核膨大，核膜呈泡狀，進而核膜破裂，染色質分散到卵子細胞質中，而且精子的染色質也從致密狀態開始松散成為顆粒狀或細絲狀，隨后泡狀的核膜在分散的染色質周圍集中形成許多小囊，這些小囊相互合并組成一雙層結構的核膜，形成雄原核。與此同時，卵母細胞完成第2次減數分裂，染色質首先分散，沿著分散的染色質邊緣匯集了一些小囊，它們也逐漸融合形成一雙層包膜，從而形成了一些內含染色質的小囊，稱為染色質泡。隨后這些小泡互相接近，包膜彼此合并形成一個形狀不規則的雌原核。雌雄原核逐漸移向卵子的中央，實現融合，染色體彼此聚攏在一起，使配子的單倍體恢復成為合子的雙倍體，完成遺傳物質的重組。

精子進入卵母細胞后，卵母細胞中形成雄原核生長因子（MPGF），MPGF可能是像核質素（nucleoplasmin）一樣的物質，是精核去致密所必需的。維持雌、雄原核形成所必需的物質，其數量是有限的，當精子進入卵中之后，精核和卵核則競相爭奪這種原核形成物質。在小鼠和大鼠，精核比卵原核對原核形成物質具有更大的親和力，因此，雄原核比雌原核大，但其他動物則不是這樣。多精子進入卵母細胞后，同時競爭原核形成物質，使原核直徑變小。原核直徑和卵母細胞發育能力具有相關性（Payne等，1997），可以用來判定體外受精后胚胎質量及發育潛力。

哺乳動物是單精受精動物，受精時只需一個精子入卵，以保證合子重新恢復二倍體。如果有一個以上精子入卵，通常會導致胚胎發育異常或發育阻滯，最終夭折。影響多精受精的因素包括以下幾個方面。

（1）卵母細胞成熟程度　與成熟的卵母細胞相比，未成熟卵由于不能發生完善的皮質反應和透明帶反應而呈現較高的多精受精率（Niwa K等，1991；Wang等，1992）。用未成熟卵子受精時，精子的穿入并不能使卵子釋放皮質顆粒（CGs）（Wang W H等，1997a；Wang W H等，1997b）。未成熟卵子的多精受精可能與以下幾個方面有關：精子穿入未成熟卵子時引起的鈣顫不明顯，即使直接向卵內注射鈣或1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）也難以奏效（Machaty等，1997；Mehlmann等，1994）；CGs在質膜下的分布不均勻；未成熟卵中內質網的數目較少（Mehlmann等，1994），內質網是儲存鈣的細胞器之一；未成熟卵上IP3受體的數目較少，致使卵子對相應激活因子的刺激不敏感（Mehlmann等，1996）。

（2）透明帶異常　透明帶主要由ZP1、ZP2、ZP3等糖蛋白構成。卵子激活時釋放到卵周隙（PVS）的CGs內容物使透明帶發生了某些改變，從而阻止了以后精子的穿越（Bauskin等，1999）。多精受精且形成多原核的受精卵，其透明帶內層有微細的間斷（Keefe等，1997）。

（3）卵泡細胞的作用　卵丘細胞和顆粒細胞上的特有成分能夠促進精子獲能和發生頂體反應。將卵丘細胞和顆粒細胞在體外培養36h或48h，再將其凍融后加入到IVF液中，可顯著地提高精子入卵率，而降低多精受精率（Wang等，1992）。在進行IVF操作時，如果在卵母細胞上保留一定數量的卵丘細胞和放射冠細胞，則可明顯提高雄原核（MPN）的形成率。如果在IVM時將卵母細胞與卵泡細胞共培養，則可提高卵母細胞內谷胱甘肽的含量和受精后囊胚發育率（Abeydeera等，1998）。

阻止多精受精的機制主要有兩條，一是雌性生殖道的初步篩選，盡管哺乳動物一次射出的精子很多，但能到達受精部位的精子卻很少，只有那些活力相當好的精子才能到達受精部位；二是卵子本身所具有的阻止多精受精的能力，卵母細胞的皮質顆粒在阻止多精受精中發揮重要的作用。

皮質顆粒是哺乳動物卵母細胞中的一種圓形的外包界膜的細胞器，許多作者認為來自高爾基復合體，也有作者在小鼠、山羊及牛卵母細胞中發現，皮質顆粒的發生與滑面內質網關系更為密切，其實歸根到底都是一個起源，因為高爾基體來自滑面內質網。皮質顆粒直徑一般在0.2～0.6μm，內含不同電子致密度的、均質的內容物。原始卵泡中的卵母細胞通常不含皮質顆粒，卵泡開始生長以后，皮質顆粒才開始形成，在不同動物出現的時間不同，在小鼠和大鼠中，由單層卵泡細胞包圍的初級卵泡的卵母細胞中就出現皮質顆粒；在牛中，由兩層以上卵泡細胞包圍的卵母細胞中出現皮質顆粒（譚景和等，1992）；人及兔卵母細胞皮質顆粒在次級卵泡階段出現（Cran等，1985）。隨著卵母細胞的生長，皮質顆粒的數量不斷增加。

近年來，人們以熒光素標記的植物凝集素為分子探針、利用激光共聚集顯微術研究了一些哺乳動物卵母細胞成熟過程中CGs遷移和重分布情況（Byers等，1992；Yoshida等，1993；Wang等，1997；Carneiro等，2002；Velilla等，2004）。研究結果表明，多數哺乳動物，GV期卵母細胞的CGs分布在整個皮質胞質。卵母細胞不論是在體內成熟還是在體外成熟期間，均發生皮質顆粒向皮質遷移，當卵母細胞完成核成熟、到達MⅡ期時，CGs沿質膜下呈線狀排列，有些物種卵母細胞內CGs的分布存在明顯的極性，第2次減數分裂紡錘體所在的區域，其質膜下沒有CGs，這個區域被稱為無CGs區（cortical granules-free domain，CGFD）。在小鼠，CGFD約占整個卵子表面的40%，且該區域常無微絨毛分布（譚景和等，1995）。精子入卵后，激發卵質膜下的皮質顆粒發生胞吐（或稱皮質反應），從精子入卵點開始向四周擴散，外排的皮質顆粒內容物中含有蛋白酶或糖苷酶，可溶解透明帶ZP₃（糖蛋白）而阻止多余精子與透明帶相結合，避免多精受精的發生（譚景和，《脊椎動物比較胚胎學》）。精卵結合時卵母細胞被激活，CGs釋放并與質膜融合發生胞吐，引起皮質反應。胞吐到卵周隙的酶類引起透明帶糖蛋白結構的改變，阻止了因其他精子再次穿卵而產生的多精入卵，這稱為透明帶反應。近年來，卵母細胞成熟過程中皮質顆粒遷移及在皮質區的重新分布作為判斷卵母細胞胞質成熟的一個指標為越來越多的研究者所接受（Velilla等，2004）。

目前認為，影響卵母細胞成熟過程中CGs遷移和重分布的因素主要有（Liu等，2005）：生發泡破裂（GVBD）是否發生；細胞骨架；卵丘細胞；體外成熟培養液成分。1998年，Connors等用dbcAMP抑制小鼠卵母細胞GVBD的發生，結果CGFD不能形成，說明CGs在皮質區的重分布需要GVBD。對豬（Kim等，1996；Sun等，2001a）和小鼠（Connor等，1998）的研究表明，微絲參與卵母細胞成熟期間CGs遷移和重新分布，在細胞松弛素D（cytochalasin D，CD）處理的卵母細胞中，MⅠ期紡錘體保留在卵母細胞中間，極體不能排出，CGs仍然停留在胞質內部，CGFD沒有形成；微管的破壞不影響CGs向皮質區遷移，也不影響CGs重新分布。

許多研究結果表明，性成熟前動物多精受精比例顯著高于成年動物，導致體外胚胎發育能力下降，而皮質顆粒在成熟過程中遷移不完全或提前發生胞吐是發生多精受精的重要原因，因此研究性成熟前動物皮質顆粒遷移情況，對于幼年動物卵母細胞發育能力的研究有非常重要的意義。

4.卵泡直徑和卵母細胞直徑對卵母細胞發育能力的影響

哺乳動物繁殖后代的首要事件就是卵泡發育（Spicer and Echternkamp，1986），即由休眠原始卵泡開始進行生長發育。在性成熟以前，原始卵泡一旦開始生長，大多數卵泡就能夠發育到有腔卵泡期，但最終都發生閉鎖。性成熟以后，少數卵泡被促性腺激素挽救而繼續生長（即周期性募集），經過卵泡選擇和優勢化以后，一個或數個卵泡發育成熟并排卵（Hirshfield 1991），其他99%以上進入生長群的卵泡發生閉鎖（Ireland，1987）。成熟卵泡的大小因物種不同而有所差異，一般牛卵泡達12～19mm、羊卵泡發育至5～8mm、豬卵泡直徑8～12mm、馬卵泡為25～4mm時即可視為成熟卵泡，此時由于卵泡腔擴大顆粒細胞分裂增殖停止，而使顆粒細胞層變薄僅為2～3層（沈芬霞等，2000）。

卵母細胞發育能力是隨著卵泡和卵母細胞生長發育逐漸獲得的。在這一過程中，卵母細胞存儲RNA和蛋白質，細胞核發生GVBD，染色質凝集，第一極體排出，以及M-II抑制，卵胞質發生細胞器重排、MAPK和MPF活性變化、Ca²⁺釋放機制等變化。卵泡直徑和卵母細胞直徑是衡量卵母細胞質量的一個指標，大卵泡獲得的卵母細胞發育能力顯著高于小卵泡（Furher等，1989），卵母細胞直徑越大，發育能力越強（mouse：Wu等，2007）。有報道表明，22天和26天小鼠卵母細胞發育能力有顯著差異，取相同大小的22天和26天小鼠卵母細胞體外受精后，26天小鼠卵母細胞發育能力顯著高于22天，這說明卵母細胞獲得發育能力是與卵泡發育有關的。26天小鼠卵母細胞隨著直徑的增加發育能力增加（Eppig等，1992）。卵泡和卵母細胞發育同步化，反映顆粒細胞增殖程度和卵母細胞生長同步化程度和能否用卵泡大小判斷卵母細胞發育能力。以前的報道表明豬和綿羊性成熟后卵泡細胞和卵母細胞發育才同步化（Grazyna Ptak等，2006），性成熟前羊卵母細胞和卵泡發育同步化沒有成年羊好（0.11vs.0.61）。在成年動物中卵泡直徑和卵母細胞直徑相關（cattle：Fair等，1995；buffalo：Raghu等，2002），并且和發育能力有關（cattle：Furher等，1989）。觀察小牛和成年母牛卵母細胞體外成熟的幾項特征，發現小牛卵母細胞的平均直徑（118μm±1.15μm）比成年母牛的卵母細胞平均直徑（122.83μm±0.74μm）小。牛直徑為2～6mm的卵泡為體外培養最佳卵泡，小于2mm卵泡發育能力很低，卵泡卵母細胞的減數分裂能力和胞質成熟能力差；直徑大于6mm的卵母細胞其卵裂率及囊胚發育率顯著高于直徑2～6mm小卵泡卵。Pavlok實驗證實，2～8mm之間卵泡卵母細胞有相似率及囊胚發育率，而小于2mm卵泡卵幾乎完全缺乏發育至囊胚的能力（Pavlok A等，1992；Lonergan P等，1994）。

5.卵丘細胞對卵母細胞發育能力的影響

卵母細胞的成熟發育與其周圍的卵泡細胞的作用是分不開的。卵泡細胞和卵母細胞伸出突起穿過透明帶互相聯系。在卵母細胞的成熟和受精過程中起著重要作用（Fukui and Sakuma，1980；Fukui and Ono，1989；Zhang等，1995）。卵母細胞在離開卵泡環境后能自發地恢復減數分裂，而細胞核成熟的完成并不能保證細胞質的成熟，1990年Buccione等指出，卵母細胞與卵丘細胞之間的縫隙連接對卵母細胞的生長和減數分裂的維持非常重要，卵丘細胞中的cAMP能促進成熟抑制因子的產生和激活，這些因子轉運到卵母細胞，抑制或延遲卵母細胞減數分裂恢復（Eppig and Downs，1984）。

同時，卵母細胞對卵丘細胞的擴展也有調節作用（Buccione等，1990），而卵丘細胞的擴展又影響卵母細胞的成熟。卵丘細胞的擴展，可以使卵丘細胞與卵母細胞間的縫隙連接數量減少或終止，從而導致由卵丘細胞向卵母細胞傳遞的卵母細胞成熟抑制物質減少或消失，進而引起卵母細胞減數分裂恢復，卵母細胞對卵泡細胞甾類激素的合成和分泌也具有調節作用（Vanderhyden and Tonary，1989）。然而一些作者也證明成熟培養液中加入顆粒細胞對細胞質成熟沒有作用。

卵丘細胞參與誘導卵母細胞減數分裂恢復，卵丘細胞在促性腺激素促進卵母細胞減數分裂恢復的過程中起重要作用，可能的機制是，引發顆粒細胞來源的成熟誘導信號，克服卵泡的抑制環境；中斷卵丘細胞與卵母細胞之間的縫隙連接。在成熟期間，卵丘卵母細胞之間的偶聯發生了動力學上的變化，主要是卵丘細胞內縫隙連接的丟失，它可能是通過中斷從外部卵丘細胞到卵母細胞的減數分裂抑制信號的轉導來干涉卵母細胞減數分裂的恢復（Eppig and Downs，1987）。

卵丘細胞能夠吸引、捕獲和選擇精子，增加圍繞在卵母細胞周圍的精子數目；卵丘細胞能夠在體外分泌蛋白質，卵丘細胞也可能從輸卵管液和卵泡液中或從有血清的成熟培養液中捕獲蛋白質提供給卵母細胞。可刺激精子的活力，推動頂體反應，使精子對透明帶反應（Zona reaction）敏感，形成頂體反應誘導配體，精子穿過卵丘基質纖維網時，可以去掉其表面覆蓋物。另外一些功能包括，卵丘細胞產生的孕酮能夠促進精子發生卵質膜反應；促進延長卵的壽命，減緩排卵后ZP的硬化，淘汰運動能力不強的精子。在卵成熟過程中，卵母細胞分泌旁分泌因子，與FSH協同作用，可以促使卵丘細胞分泌透明質酸，從而促進卵丘擴展，有利于精子穿入卵丘。

卵母細胞和卵泡細胞相互作用是一個雙向的過程，卵泡環境決定卵母細胞發育能力，卵母細胞的旁分泌因子對卵泡的發育也有重要作用，在沒有卵母細胞的情況下，卵泡不能生長和發育，卵母細胞對卵泡細胞發育的調節方面的研究始于將兔的卵母細胞去掉，卵泡細胞就發生黃體化。卵母細胞分泌的因子調節卵泡細胞的功能，包括卵丘細胞黏液化和透明質酸的產生（Buccione等，1990）；細胞增殖，類固醇生成和抑制素的合成；urokinasetype plasminogen activator（uPA），促黃體激素受體的生成（LHR），and kit-ligand（KL）。卵母細胞分泌因子TGFβ包括TGFβ1、GDF-9和BMP-15，能夠模擬卵母細胞對卵泡細胞的作用，GDF-9、BMP-15缺乏的小鼠和綿羊卵泡發育不正常。

6.卵母細胞胞質中GSH對卵母細胞發育能力的影響

谷胱甘肽是一種巰基三肽，全稱為γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，是在哺乳動物機體中廣泛分布的一種主要的非蛋白巰基復合物，體細胞和配子中均有存在。谷胱甘肽以兩種形態存在，即還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），但在哺乳動物細胞中，約90%以上的GSH以還原型存在。在谷胱甘肽過氧化物酶類和谷胱甘肽還原酶類的作用下，GSH和GSSG發生相互轉化，同時與過氧化氫或其他有機氧化物反應，從而起到解毒的作用。轉化分子式如下。

（1）卵母細胞胞質中GSH的合成　在細胞中，半胱氨酸和谷氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用下生成γ-谷氨酰半胱氨酸，其中半胱氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶分別是GSH合成的限速底物和限速酶。γ-谷氨酰半胱氨酸再與甘氨酸在GSH合成酶的作用下進一步生成GSH（圖1-1）。

在許多低等有機體γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCL）是單獨的多肽，大多數真核生物GCL酶是異二聚體復合物（包括兩個不同基因的產物），催化亞基較大（GCLC 637 amino acids，approximately 73kDu），包含ATP依賴的結合半胱氨酸的氨基和谷氨酸的羧基的活性位點。調節亞基較小（GCLM 274 amino acids，approximately 31 kDu），通過直接與GCLC作用增加GCLC的催化效率。GCLM降低谷氨酸和ATP的K_m，增加GSH反饋抑制的K_i（Meister等，1983）。GSH競爭性地抑制GCL，通過和谷氨酸競爭GCLC的活性位點，GCLC有低的催化活性，催化半胱氨酸和谷氨酸結合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，調節亞基沒有催化活性，但能與催化亞基結合，調節催化亞基的催化效率（Huang等，1993）。GCLM通過降低GSH的反饋抑制調節酶的活性（Huang等，1993），正常生理條件下，GSH的合成受兩個因素影響——半胱氨酸的利用和GCL活性，細胞培養液中半胱氨酸迅速氧化成胱氨酸，進入細胞后，迅速被還原為半胱氨酸。有報道表明，添加BSO（抑制GCL活性）能顯著降低谷胱甘肽的合成，增加了顆粒細胞凋亡和卵母細胞碎裂。正常生理條件下，GCLC沒有催化活性，和Gclm結合才起作用。調節GCL的兩個亞基基因表達，能夠調節細胞內GSH的合成。在卵巢中健康卵泡Gclm表達水平高，而閉鎖卵泡Gclm表達量低，排卵前促性腺激素刺激使得膜細胞Gclm顯著增加，促性腺素處理后GCLC和Gclm水平增加，GCL酶活性增加，使得卵巢GSH合成顯著增加（Luderer等，2001）。

（2）GSH在卵母細胞成熟、受精及早期胚胎發育過程中的作用　細胞內谷胱甘肽的合成是卵母細胞胞質成熟過程中的一個重要部分。許多學者認為卵母細胞體外成熟后GSH的含量是卵母細胞胞質成熟的有效標示之一（Abeydeera等，1998；de Matos等，1997；de Matos等，2000）。可見，GSH在卵母細胞成熟過程中發揮著重要的作用。

①使細胞免受自由基和代謝產生的氧化型中間產物（如過氧化物）的氧化損傷（Meister等，1983）。

a. GSH作為輔酶，通過調節氧化還原反應，調節蛋白和DNA合成。GSH能夠保護紡錘體免受氧化損傷，以維持減數分裂紡錘體正常的形態和功能，確保正常的合子形成。

b. GSH能夠維持配子細胞膜的穩定。細胞外的GSH能夠清除培養液等細胞外環境中的ROS，從而抑制配子細胞膜上的脂質過氧化反應，防止細胞外物質對配子的損傷（Brad等，2003）。

c. GSH保護蛋白質免受氧化損傷。GSH能夠與配子細胞內蛋白質結合成混合的二硫化物（蛋白質-S-S-谷胱甘肽），從而起到保護蛋白質的作用（Bernard等，1995）。

②GSH參與精子染色體解凝、卵母細胞激活、雄原核形成等過程。GSH參與倉鼠（Perreault等，1988）、豬（Yoshida等，1993）和牛等動物的受精和雄原核形成。GSH提供啟動雄原核形成之前染色質解凝聚所需的還原基團。精子染色體解凝是雄原核形成的第一步，而精子染色體的解凝需要精子染色體中的二硫鍵的還原來誘導。GSH是精子內重要的巰基，是二硫鍵還原的重要影響因素。

③GSH參與氨基酸的轉運，促進蛋白質的合成。Meister首先提出了γ-谷氨酰循環，解釋了谷胱甘肽在氨基酸跨膜轉運中的機制，見圖1-2。

④GSH參與卵母細胞受精和早期胚胎發育過程。在許多哺乳動物中，卵母細胞成熟過程中合成GSH，在小鼠（Calvin等，1986）、倉鼠、豬（Yoshida等，1992）、牛（de Matos等，1996；de Matos and Furnus，2000）和羊（de Matos等，2002）.中都有報道。卵母細胞在卵巢內發育成熟過程中，卵母細胞內GSH的濃度會隨著排卵的臨近而持續升高，卵母細胞成熟期間GSH的積累將會改善卵母細胞的胞質成熟質量、保護卵母細胞在受精后的胚胎發育階段免于受到氧化損傷（de Matos等，2000）。卵母細胞受精后，GSH濃度顯著下降，這表明GSH參與了卵母細胞的受精過程，主要是參與受精后雄原核形成過程（de Matos等，2002）。已經有報道指出，向豬、牛卵母細胞體外成熟培養液中添加能夠促進GSH合成的物質將會提高卵母細胞發育到囊胚的能力（De Matos and Furnus，2000）。卵母細胞在含有新生牛血清（newborn calf seum，NBCS）、PVA（polyvinyl alcohol，PVA）、半胱氨酸和表皮生長因子的成熟液中成熟后，卵母細胞的成熟率高于僅僅添加PVA組卵母細胞的成熟率。在豬卵母細胞體外培養液中增加半胱氨酸和表皮生長因子可以提高卵母細胞的成熟率及顯微受精（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）胚的卵裂率，這可能也是由于增加GSH的濃度的緣故。研究表明，在生理條件下，成熟的小鼠和倉鼠卵母細胞中高的GSH濃度是受精后形成雄性原核和促進早期胚胎發育的基礎。GSH水平標志著哺乳動物胚胎質量和發育能力。成熟MⅡ（metap haseⅡ stage，MⅡ）期卵母細胞中GSH的含量最高。一般來說，MⅡ卵母細胞中GSH濃度是生發泡破裂時卵母細胞的2倍。如用人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadot ropin，HCG）誘導倉鼠排卵，卵母細胞中GSH濃度在隨卵母細胞的發育而增加，從GV階段的1.0pmol/Oocyte到MⅠ階段期的1.62pmol/Oocyte，最后增加到MⅡ階段的2.0pmol/oocyte。然而，在受精合子和胚胎發育的早期，GSH水平下降非常快。在倉鼠胚胎植入前到囊胚階段，GSH的濃度還達不到MⅡ卵母細胞中GSH濃度的10%。已排卵的卵母細胞中相對高的GSH濃度可以作為胚胎發育到孵植前抗氧化的潛在儲庫。

半胱胺能夠提高半胱氨酸吸收，增加GSH合成所需的底物（Meister等，1983）。體外成熟培養液中添加半胱胺能改善雄原核的形成，在山羊（Rodriguez-Gonzalez等，2003）、水牛和豬上都有研究。缺乏半胱胺對雄原核形成有影響在豬和牛上也有報道。半胱胺增強精子去凝集在體外成熟的倉鼠卵母細胞上都有報道。GSH能促進雄原核形成物質的形成。

（3）半胱胺和胱氨酸在促進卵母細胞GSH合成作用　在卵母細胞中，低分子質量的巰基化合物催化合成谷胱甘肽，這些巰基化合物的有效成分為含硫氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸、半胱胺或β-巰基乙醇。巰基化合物誘導GSH合成提高合子中GSH的濃度，促進胚胎發育到囊胚階段。大量的證據證明，GSH是在γ-谷氨酸循環中合成，而且它的合成依賴于氨基酸前體（如半胱氨酸）的獲得。另一方面，胱氨酸可能是被卵丘細胞轉變為半胱氨酸，然后參與GSH的合成。此外，其他低分子巰基化合物（如半胱胺、β-巰基乙醇）能夠還原胱氨酸為半胱氨酸。

半胱胺作為重要的巰基物質，目前關于它的研究主要集中在應用其改善卵母細胞成熟質量方面。現在已經證明牛、豬、水牛、山羊、綿羊和成鼠等在卵母細胞體外成熟過程中添加半胱胺能促進細胞內GSH合成，幫助穿卵精子解聚和雄原核形成，進而提高胚胎發育水平。TCM199中的半胱氨酸含量很低（0.6μM）且十分不穩定，易被氧化成為胱氨酸（Sagara等，1993），這樣就可能會使GSH合成受阻。TCM199中胱氨酸的含量相對較高（83.2μmol/L），有實驗證明像半胱胺和β-巰基乙醇這樣的低分子量的巰基物質能夠通過還原胱氨酸為半胱氨酸，并通過促進細胞對半胱氨酸的利用來促進GSH合成。

目前的實驗結果表明，GSH的合成取決于培養液中半胱氨酸的利用，半胱氨酸是唯一的氨基酸前體，在卵母細胞中通過丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸運輸體系被吸收。然而，在細胞外環境中半胱氨酸非常不穩定，易被氧化成胱氨酸，降低GSH的合成。牛體外成熟培養液中添加胱氨酸僅能促進COCs GSH的合成，卵丘細胞在將胱氨酸轉化為半胱氨酸過程中發揮了重要的作用。IVM培養液中同時添加半胱胺和胱氨酸，在沒有卵丘細胞存在的條件下也提高了卵母細胞中的GSH含量。低分子量的巰基化合物，例如半胱胺和β-巰基乙醇，添加到成熟培養液中能夠提高GSH水平，改善豬體外受精卵母細胞發育能力。

（三）研究的主要內容

針對性成熟前動物得到的卵母細胞發育能力差這個問題，我們以不同周齡的小鼠為研究模型，進行了以下幾個方面的研究，希望能找出性成熟前動物卵母細胞發育能力差的原因，從而提高性成熟前動物卵母細胞發育能力。

①卵泡直徑和卵母細胞直徑是衡量卵母細胞質量的一個指標，直徑大的卵泡卵母細胞發育能力顯著高于小直徑的卵泡卵母細胞，卵泡和卵母細胞發育同步化程度反映卵泡內顆粒細胞的數量，這些問題在性成熟前后卵泡、卵母細胞上是否有差別。

②多精受精是性成熟前動物卵母細胞體外受精后普遍存在的問題，多精受精導致胚胎發育異常或發育阻滯，所以我們需要深入研究多精受精產生的原因，降低多精受精比例，提高囊胚發育率。

③促性腺激素能增加大的有腔卵泡的數量，但是對卵母細胞發育能力的影響眾說紛紜，我們以小鼠為實驗模型繼續深入研究促性腺激素對性成熟前動物卵母細胞發育能力、多精受精情況的影響。

④谷胱甘肽是卵母細胞胞質中存在能夠促進雄原核形成的物質，近年來被普遍認為是卵母細胞胞質成熟的指標，成熟培養液中添加胱氨酸和半胱氨酸能夠促進卵母細胞胞質中谷胱甘肽的合成，從而改善卵母細胞發育能力，這在性成熟動物中都已經被證明，能否改善性成熟前動物卵母細胞發育能力，以及改善的程度值得研究。

⑤對于卵母細胞胞質中谷胱甘肽合成來說，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和GSH合成酶是最為關鍵的兩個酶，其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶包括催化亞基（GCLC）和調節亞基（GCLM），這些酶在性成熟前后小鼠卵母細胞中表達是否存在差別需要進行研究。

⑥促性腺激素對卵母細胞胞質中GSH的合成能力以及對GSH合成最為關鍵的兩個酶是否存在影響，需要我們進行研究。

二、材料與方法

（一）主要試劑及配制

若無特殊說明，實驗所用試劑均購自Sigma公司。試劑配制及分裝時所用的玻璃器皿都是采用170℃高溫干熱2h以上滅菌的；塑料平皿都是采用紫外燈照射40min以上滅菌的；其他塑料器皿都經過120℃、1.5個大氣壓濕熱滅菌15～30min。

卵母細胞成熟培養液：TCM-199（Gibco，Grand Island，New York，USA）添加10%（體積分數）FCS（GIBCO）、24.2mg/L丙酮酸鈉、0.05IU/ml FSH、0.05IU/ml LH、1μg/ml 17β-雌二醇、10ng/ml EGF、100IU/ml的青霉素和0.05mg/ml硫酸鏈霉素。半胱胺和胱氨酸分別配制成20mmol/L和100mmol/L濃儲液，培養時根據實驗需要用成熟培養液進行稀釋使用。培養條件為：20～30枚卵母細胞/100μl成熟培養液，覆蓋石蠟油，37℃，5%CO₂，100%濕度。

M2操作液：每100ml七蒸水中加入NaCl 0.55319g、KCl 0.03563g、CaCl₂·2H₂O 0.02514g、KH₂PO₄ 0.016195g、MgSO₄ 0.0143276g、NaHCO₃ 0.035g、Hepes 0.496855g、乳酸鈉0.4349g、丙酮酸鈉0.00363g、葡萄糖0.1001912g、BSA 0.4g、青霉素0.006g、鏈霉素0.005g、酚紅鈉0.001g。

獲能及授精液：基礎液為T6液（Quinn等，1982），每100ml七蒸水中加入NaCl 0.666g、KCl 0.0238g、MgCl₂.6H₂O 0.01g、CaCl₂·2H₂O 0.0294g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.016195g、NaHCO₃ 0.209g、葡萄糖0.1g、丙酮酸鈉0.0055g、乳酸鈉0.1121g、Hepes 0.24g、酚紅鈉0.001g。獲能液為T6+10mg/mlBSA，受精液為T6液+20mg/mlBSA。

SrCl₂激活液：先用七蒸水將SrCl₂配成100mmol/l濃儲液，保存于4℃，激活前用無Ca無糖CZB將其稀釋10倍。

胚胎培養液：無糖CZB液，即每100ml超純水中加入NaCl 0.476987g、KCl 0.036008g、KH₂PO₄ 0.01606g、MgSO₄ 0.0144207g、NaHCO₃ 0.211033g、CaCl₂·2H₂O 0.0250g、乳酸鈉0.350748g、丙酮酸鈉0.00297g、EDTA 0.004094g、谷氨酰胺0.01461g、BSA 0.5g、青霉素0.006g、硫酸鏈霉素0.005g。含糖CZB液，即在無糖CZB的基礎上每100ml添加0.1g葡萄糖。

（二）實驗動物及超排處理

本實驗使用的小鼠均為昆明白品系，自繁自養。實驗所用雌鼠為成年鼠6～8周，幼鼠19～21d，雄鼠為8～12周齡。控光（黑暗20：00～次日6：00；光照6：00～20：00）超排處理：腹腔注射PMSG 10IU/只，46h后取GV期卵母細胞。

（三）卵母細胞的獲取及體外成熟

體外成熟卵母細胞的獲取：雌鼠腹腔注射10IU PMSG/只，46h后頸椎脫臼法殺鼠摘取卵巢。剔除卵巢周圍的脂肪組織和輸卵管，用M2清洗兩遍，洗去血液和脂滴。把卵巢置于M2操作液中，在實體顯微鏡下，用刺卵針挑破卵巢表面直徑大于320μm的有腔卵泡，收集卵丘卵母細胞復合體（COCs）。從收集的COCs中選取達到最大直徑（＞70μm）、卵丘完整而且致密、層數在三層以上、卵母細胞形狀規則、胞質均勻無顆粒、胞質顏色正常，呈均勻的淺黃色的GV期COCs，成熟培養液洗滌3遍后培養。

卵母細胞的體外成熟培養：采用微滴培養體系，嚴格控制培養條件（每個培養液滴體積為100μl），表面覆蓋薄層石蠟油，預平衡2h后用于培養，每滴培養30枚左右卵母細胞。將洗滌后的卵母細胞移入已平衡好的培養液滴中，置于37.5℃、5%CO₂、95%空氣、飽和濕度的CO₂培養箱內進行培養。從殺鼠至培養的全部操作限制在40min內完成。

（四）卵母細胞體外受精

選取性成熟（10～12周齡）昆明白雄鼠，已通過交配實驗證明其有受精能力，頸椎脫臼法處死，從附睪尾和輸精管收集精子，將收集的精子團塊置入1ml含10mg/ml BSA的T6液滴內，用口吸管輕輕吹打，使精子團分散開，于37℃、5%CO₂及飽和濕度的CO₂培養箱內中孵育1.5h左右，進行獲能。在此期間用細胞計數板檢測精子密度。將hCG后12h或IVM14h的卵母細胞在受精液（T6+20mg/mlBSA）中洗3次，移入已經平衡過夜的受精滴（20枚/40μl）中，加入適量體積的獲能精子，使精子密度在1×10⁶個/ml左右。培養6h后，用無糖CZB液洗去卵母細胞周圍附著精子，選取含兩原核和第二極體的受精卵，置于無糖CZB中培養。

（五）氯化鍶激活

體外成熟卵母細胞（COCs要提前脫卵丘）分別用M2液及含20mmol/L SrCl₂的無鈣無糖CZB液洗3遍，然后將卵母細胞置于含20mmol/L SrCl₂的無鈣無糖CZB液中培養2.5h，之后轉入不含SrCl₂的無糖CZB液中繼續培養3.5h，即在激活處理6h后觀察原核、統計激活率。

為了維持孤雌激活胚胎的二倍性，激活液和6h檢查原核前短期培養的培養液中均添加5μg/ml的CB。

（六）胚胎培養

將孤雌激活或體外受精后的卵母細胞移入不含CB的無糖CZB中繼續培養。當有2/3的胚胎到達4-細胞時，將胚胎換液于含5.5mmol/L葡萄糖的CZB中繼續培養至發育到囊胚。在激活或受精后的48h、72h、96h各觀察1次，記錄4-細胞、桑椹胚和囊胚的發育情況。

（七）多精受精觀察

體外受精8h取出受精卵，用孔徑與受精卵直徑接近的擼卵針將周圍的精子去掉，放在玻璃載玻片上制成標本。標本用醋酸酒精溶液（體積比1∶3）固定至少24h后，用1%醋酸地衣紅染色，相差顯微鏡下觀察多精受精情況，將兩原核兩極體（或只有第二極體）的視為正常受精，多于進入卵母細胞的視為多精受精。原核直徑測量：體外受精8h后，將兩原核受精卵取出壓片，壓片時，蓋玻片四邊中點各放寬約20μm，厚度相同的塑料，使卵母細胞被壓扁的程度相同。標本用醋酸酒精溶液（體積比1∶3）固定至少24h后，用1%醋酸地衣紅染色，在帶有目鏡測微尺的相差顯微鏡下測量雌雄原核直徑，結果為兩者平均值。

（八）發情周期觀察

整個發情周期都伴隨著血液中激素濃度的高低變化，陰道上皮細胞也隨之變化，所以借助陰道黏液鏡檢，根據其中所含陰道上皮細胞形態，可對其發情周期所處的階段進行判斷。具體做法是暴露小鼠陰道，右手持滴管吸少量滅菌生理鹽水滴入陰道口，當稍放松尾部及腰部時，生理鹽水即被吸入陰道，稍候三指輕壓腰部，黏液隨生理鹽水流出，吸入滴管中，滴到載玻片上涂片，片子自然干燥后用酒精（95%）固定5min，然后用1%伊紅染液染15min，水洗干燥后在光學顯微鏡下觀察。

根據陰道上皮細胞變化情況，將發情周期分為以下4個階段。

Ⅰ期（發情前期）：黏液中有上皮細胞，有核細胞居多。

Ⅱ期（發情期）：涂片中幾乎全是無核的或有核的角化上皮細胞，細胞大而扁平，邊緣不整齊。

Ⅲ期（發情末期）：少量較老的有核細胞呈散在，其間有許多白細胞。

Ⅳ期（間情期）：涂片中幾乎全是白細胞。

在整個過程中對小鼠的操作動作小心輕柔，向陰道口滴與從陰道口回吸生理鹽水時吸管盡量不碰到陰唇。

（九）卵母細胞谷胱甘肽含量的測定

根據1994年Funahashi等采用的方法進行卵母細胞谷胱甘肽含量檢測。將未成熟和不同條件下成熟的卵母細胞脫卵丘，M2洗3次后用無菌蒸餾水再洗2次。將洗滌后的卵母細胞（35～40個）移入含5μl蒸餾水和5μl 1.25mmol/L磷酸的1.5ml離心管中。若不立即檢測活性，可將樣品存于-70℃備用。若立即檢測活性，可將樣品反復凍融3次，然后應用DTNB-GSSG還原酶實驗檢測GSH含量。向樣品離心管中加入700μl封閉緩沖液（含有0.33mg/ml NADPH，0.2mmol/L磷酸鈉，10mmol/L EDTA；調整緩沖液pH值為7.2），100μl含6mmol/L DTNB液，然后加入10μl 250IU/ml GSH還原酶，迅速混勻以起始反應。用可見光分光光度計在412nm處檢測光吸收值，每30s中記錄1次數據，記錄3分鐘內的幾次光吸收值。本實驗中需同時檢測標準GSH樣品（分別含0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、1.0mmol/L GSH）和空白樣品（不含GSH）的光吸收值，以作為陽性和陰性對照。將每個樣品的GSH含量除以樣品所包含的卵母細胞數即為每個卵母細胞的GSH含量。

（十）皮質顆粒染色

除特殊說明外，所有的實驗步驟均在室溫下進行。將收集的體內及體外成熟卵母細胞、受精卵和孤雌激活卵在含0.5%鏈霉蛋白酶（Roche）的M2液中于37℃消化3～5min，除去透明帶。卵母細胞在M2中洗3次后，用含3.7%多聚甲醛的PBS在室溫下至少固定30min；然后用封閉液（blocking solution含0.3% BSA和100mM甘氨酸的M2）洗3次，每次至少5min；用含0.1% TritonX-100的M2處理5min；用blocking solution清洗2次后，在避光條件下，卵母細胞在含100μg/ml異硫氰酸熒光素標記的扁豆凝集素（FITC-LCA）的M2中至少孵育30min。然后用含0.3% BSA和0.01% TritonX-100的M2洗3次，每次5min，卵母細胞核用含10μg/ml碘化丙錠（PI）的M2孵育10min，以評價細胞核的階段和精子穿透。用M2充分清洗后，卵母細胞被放在玻璃載玻片上制成標本，放到暗盒中待觀察。

（十一）激光掃描共聚焦顯微術

制備好的樣品，用裝有氪-氬離子激光管的Leica TCS SP Ⅱ型激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并照相。Hoechst 33342的熒光用二極激光管的405nm波長激發。FITC和PI的熒光用Ar/ArHr激光管的488nm波長激發，發射光通過一個488nm的濾片。單個的視覺截面是假顏色，用Leica共聚焦軟件組合成一個復合的圖片。

（十二）卵泡直徑、卵母細胞直徑的測量

用扎卵針分離性成熟前后小鼠卵泡，在帶有目鏡測微尺的顯微鏡下測量，劃破卵泡，取出卵母細胞，測量卵母細胞的直徑，顯微鏡倍數為400倍。

（十三）定量PCR

1.藥品

藥品見表1-1。

2.儀器

儀器見表1-2。

3.主要數據庫

GenBank：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.

4.試劑配制

5×TBE電泳緩沖液：750ml雙蒸水中溶解54g Tris · base、27.5g硼酸、4.65g EDTA。

50×TAE電泳緩沖液：750ml雙蒸水中溶解242g Tris堿，加入57.1ml冰乙酸、100ml 0.5M EDTA（pH8.0），用雙蒸水定容至1000ml。

0.1%DEPC處理水：1000ml雙蒸水加1ml DEPC，混勻，37 ℃過夜，高壓滅菌

5. RNA的提取

凡與RNA操作有關的玻璃器皿和剪刀、鑷子等器械經常規洗滌烘干后，用錫箔紙包好，200℃烘烤2～4h。塑料制品用0.1% DEPC浸泡處理37℃ 2h，或室溫處理過夜，再用滅菌雙蒸水漂洗數次，高壓滅菌去除DEPC。

GV期卵丘卵母細胞復合物，離心（2000～3000g/5～10min）棄上清，加入適量trizol，劇烈振蕩15s至液體澄清，-70℃保存，trizol終體積500μl。

①向trizol離心管中加100μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2～3min。

②4℃ 12000g離心15min，見分層。

③用黃槍頭吸取上層水相，約200μl，置另一離心管中（不要吸到中間層的有機相）。

④向離心管中加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min，現RNA沉淀。

⑤DEPC·H₂O配75%乙醇。

⑥離心完后棄上清，加500μl 75%乙醇，用指輕彈管壁使RNA沉淀飄起。

⑦4℃ 7500g離心15min，沉淀即總RNA，棄乙醇，用離心機再甩一下離心管，用黃槍頭將乙醇吹出，打開管蓋，稍涼。

⑧加入10μl DEPC·H₂O，輕彈幾下讓RNA溶解。

⑨分裝后-80℃保存。

6. RNA濃度和質量檢測

分別采用1.5%普通瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計法檢測定RNA的抽提質量和濃度。根據測定濃度將各RNA樣品稀釋為1μg/μl。電泳檢測RNA提取質量，所提取RNA A₂₆₀/A₂₈₀在1.8～2.0之間時，用作RT-PCR分析。

7. cDNA的合成

cDNA合成參照Invitrogen公司的SuperScriptⅢ^TM Reverse Transcriptase說明書進行。采取20μl體系進行反轉錄，具體操作如下。

①在DEPC處理過的0.2mL反應管中加入相關混合液（表1-3）。

②PCR儀中65℃保溫5min，迅速取出置于冰上急冷2min以上，這樣可以減弱二級結構的影響，提高反轉錄效率。

③高速離心數秒使模板RNA、引物等混合液聚集于管底。

④配制反轉錄反應液（表1-4）。

⑤PCR儀中50℃保溫1h，然后70℃保溫15min后冰上冷卻，-20℃保存待用。

8. QPCR反應

（1）定量PCR所用引物設計及合成　根據GeneBank中已公布的小鼠Gclc、Gclm、Gss、Gapdh基因序列，根據跨內含子的引物設計原則，分別利用DNAMAN、OLIGO6.0、Prime5.0軟件設計各基因引物，交由上海生物工程公司合成。將合成的引物用DEPC處理的五蒸水配制成100μmol/L的原液，-20℃保存，使用時稀釋為10μmol/L的工作液。定量PCR所用引物見表1-5。

（2）實時熒光定量PCR

①熒光定量PCR反應體系。實時熒光定量PCR采用SYBR Green I染料法，采用Stratagene公司的BrilliantⅡSYBR Green QPCR Mastr Mix試劑盒方法進行。反應在Stratagene MX3000P熒光定量PCR儀上進行。反應體系10μl，體系成分見表1-6。

②定量PCR標準曲線、擴增曲線、溶解曲線的獲得。對用于定量的每個模板取等量cDNA混勻到一個PCR管內，依次進行5×梯度稀釋，制作5～7個濃度梯度（即原始濃度、5×、25×、125×、625×，依此類推）。目的基因和持家基因均按照上述PCR步驟進行擴增，得到標準曲線。根據斜率（k）計算出擴增效率，計算公式為擴增效率e=10^1/（-k）-1。當目的基因的擴增效率和持家基因的擴增效率相近（即二者的斜率相差不超過0.2）時，可以使用“平均相對含量=2^-△△ct”法來計算該基因的相對表達量。具體計算方法參照Livak and Schmitten（2001）的方法。

標準曲線符合條件后，選擇合適的稀釋倍數，對每一個cDNA樣品分別進行目的基因和持家基因的擴增，單個樣品均做3次重復，得到ct值，選擇ct值變異系數小于1.5%的用于計算每個樣品的平均ct值。

溶解曲線和擴增曲線程序自動給出，溶解曲線呈單峰為特異性擴增。

③基因mRNA相對表達量計算方法。本實驗采用SYBR Green熒光染料法進行實時熒光定量PCR擴增的檢測。SYBR Green實時定量PCR是通過對PCR擴增過程中熒光信號的變化實時監測PCR每一循環擴增產物量的變化。熔解曲線鑒定PCR產物的特異性，如果在引物設計后預期產物T_m值處出現單一的曲線峰表示PCR產物是特異性的，而非特異性產物形成多個分離的曲線峰。ct值是反應體系內熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數，通過測定ct值可反映出基因起始模板濃度，ct值越小則模板濃度越大，反之越小。以管家基因（GAPDH）作為內標基因，通過對待測基因以及內標基因的均一化處理可測定出待測基因轉錄表達的相對量。因為管家基因表達量相對穩定，受外界因素影響后表達變化小。

（十四）實驗結果統計及數據分析

試驗數據用SPSS 11.0軟件進行統計。試驗數據經反正弦轉換后符合正態分布，在One-Way ANOVA Options中通過Descriptive統計學分析獲得平均數和標準誤，在One-Way Analysis of Variance中通過LSD多重比較進行試驗組間差異性分析。P＜0.05為差異顯著。

三、結果與分析

（一）性成熟及促性腺激素對小鼠卵母細胞體外發育能力的影響

本實驗我們研究了不同周齡小鼠卵母細胞經體外成熟、受精后的發育能力，以及注射PMSG對性成熟前后小鼠卵母細胞發育能力的影響。小鼠卵母細胞，體外成熟14h，受精后，記錄2-細胞、4-細胞和囊胚比例。結果見表1-7。

結果表明，幼鼠卵母細胞經體外受精后卵裂率、囊胚發育率都顯著低于成年鼠（8.8% Vs 38%），4周小鼠卵母細胞囊胚發育率接近成年鼠水平（30% Vs 38%），注射PMSG能顯著提高性成熟前后小鼠卵母細胞發育能力，幼鼠由8.8%提高到51.1%，成年鼠由38%提高到57.5%，幼鼠卵母細胞發育能力達到了成年鼠水平。

（二）性成熟及促性腺激素對小鼠卵母細胞體外受精后多精受精情況及正常受精受精卵原核直徑的影響

本實驗研究性成熟和促性腺激素對小鼠卵母細胞體外受精后，多精受精及兩原核受精卵原核直徑的影響。卵母細胞體外受精8h后，用孔徑接近卵母細胞直徑的擼卵針將卵母細胞周圍的精子去掉，在載玻片上制成標本，醋酸酒精溶液（體積比1∶3）固定至少24h，用1%地衣紅染色，相差顯微鏡下觀察正常受精和多精受精及正常受精的受精卵的原核直徑，正常受精為兩原核加一個或兩個極體，多精受精為多于一個精子進入卵母細胞，精子穿透率為正常受精和多精受精總和。原核直徑測量：壓片時，蓋玻片四邊中點各放寬約20μm、厚度相同的塑料，使卵母細胞被壓扁的程度相同，在帶有目鏡測微尺的相差顯微鏡下測量，結果為雌雄原核直徑平均值。

結果證明，性成熟前后小鼠卵母細胞經體外受精后，精子穿透率沒有差別，注射PMSG能顯著提高精子穿透率（幼鼠80.9% Vs 95.5%，成鼠86.0% Vs 95.1%）；幼鼠卵母細胞多精受精比例顯著高于成鼠（54.3% Vs 37.7%），且幼鼠多精受精沒有形成原核的比例顯著高于成年鼠（74.9% Vs 38.3%），兩原核受精卵原核直徑在成鼠和幼鼠之間沒有顯著差異；PMSG處理顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細胞兩原核受精卵的比例（幼鼠27.1% Vs 69.9%，成鼠48.9% Vs 74.5%），降低了多精受精（幼鼠54.3% Vs 26.2%，成鼠37.7% Vs 20.6%）和受精后未形成原核（幼鼠74.9% Vs 16.2%，成鼠38.3% Vs 11.3%）的比例，原核直徑也有顯著提高，幼鼠原核直徑由27.78μm顯著提高到41.67μm，成年鼠原核直徑沒有顯著提高，注射PMSG前后分別為34.25μm、40.42μm，幼鼠受精卵原核直徑達到了成鼠水平。表1-8為性成熟前后小鼠卵母細胞體外受精后受精情況及兩原核受精卵原核直徑的比較。

（三）性成熟及促性腺激素對小鼠卵母細胞體外受精后正常受精卵（兩原核受精卵）發育能力的影響

本實驗研究性成熟及促性腺激素對小鼠卵母細胞體外受精后正常受精卵（兩原核受精卵）發育能力的影響卵母細胞經體外成熟、受精后選取兩原核受精卵體外培養，記錄受精率及囊胚發育率。

結果表明（表1-9），性成熟前小鼠卵母細胞經體外受精后正常受精比例顯著低于成年鼠（30.6% Vs 46.0%），注射PMSG后顯著提高了正常受精的比例（幼鼠30.6% Vs 79.7%，成鼠46.0% Vs 76.7%），幼鼠正常受精比例達到成年鼠水平；兩原核受精卵體外培養后，幼鼠囊胚發育率顯著低于成年鼠（幼鼠14.8% Vs 44.5%，成鼠35.6% Vs 45.9%），注射PMSG后顯著提高了性成熟前后卵母細胞的囊胚發育率，幼鼠由14.8%提高到44.5%，成鼠由35.6%提高到45.9%，且幼鼠達到成鼠水平。

（四）發情周期對成年鼠卵母細胞發育能力的影響

考慮到發情周期對成年鼠卵母細胞發育能力的影響，我們選擇前期和間期小鼠卵母細胞進行體外成熟、受精以及受精卵的體外培養，觀察發情周期對成年鼠卵母細胞發育能力是否有影響。

結果表明，前期和間期小鼠卵母細胞經體外成熟、受精后，卵母細胞受精率及囊胚發育率都沒有差別，前期和間期小鼠受精率分別為39.4%和45.9%，囊胚發育率分別為27.8%和30.8%，結論是成年鼠的發情周期對卵母細胞發育能力沒有影響。

（五）性成熟及促性腺激素對小鼠卵母細胞體外成熟后皮質顆粒分布的影響

不同周齡小鼠卵母細胞體外成熟14h后，按材料方法進行CGs染色和激光共聚焦顯微鏡觀察。根據2005年Liu等對卵母細胞皮質顆粒分布階段的描述，MⅡ期卵母細胞的皮質顆粒應該沿質膜下呈線狀排列，在紡錘體的上方出現無皮質顆粒區，卵母細胞成熟后皮質顆粒遷移不完全或提前發生胞吐都會導致多精受精。

結果表明，體外成熟后3周和4周小鼠卵母細胞皮質顆粒遷移不完全比例沒有顯著差別（71.1% Vs 63.9%），4周和6～8周皮質顆粒遷移不完全比例沒有顯著差別（63.9% Vs 58.7%），6～8周皮質顆粒遷移不完全比例顯著低于3周小鼠，比例分別為71.1%和58.7%；注射PMSG后顯著提高了皮質顆粒遷移完全的比例，3周小鼠皮質顆粒遷移完全的比例從21.9%提高到70.1%，6～8周小鼠皮質顆粒遷移完全的比例從36.7%提高到73.4%，3周和6～8周小鼠卵母細胞皮質顆粒遷移完全的比例沒有顯著差別，提前胞吐的比例在性成熟前后及注射PMSG前后都沒有差別。（表1-11）

（六）性成熟及促性腺激素對小鼠卵母細胞胞質中GSH含量的影響

本實驗研究不同周齡小鼠卵母細胞體外成熟后，卵母細胞胞質中GSH含量，及注射PMSG后對GSH含量的影響。體外成熟14h的MⅡ卵母細胞，按材料方法檢測GSH含量。結果表明，體外成熟后，3周小鼠卵母細胞胞質中GSH含量顯著低于4周和6～8周，分別為1.68pmol/Oocyte、2.28pmol/Oocyte和2.46pmol/Oocyte，4周和6～8周GSH含量沒有差別，注射PMSG能顯著提高性成熟前后小鼠卵母細胞胞質中GSH含量。幼鼠卵母細胞GSH含量達到了成年鼠水平（2.94pmol/Oocyte Vs 2.96pmol/Oocyte）（表1-12）。

（七）添加胱氨酸和半胱胺對性成熟前后小鼠卵母細胞及促性腺激素處理的小鼠卵母細胞發育能力的影響

本實驗中，我們研究了向成熟培養液TCM-199中添加胱氨酸和半胱胺對性成熟前后自然周期小鼠卵母細胞及促性腺激素處理的小鼠卵母細胞發育能力的影響。結果如下（表1-13）。

①添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）能顯著提高性成熟前后小鼠卵母細胞胚胎發育能力，幼鼠囊胚發育率由15.5%提高到24.0%，成鼠由30.1%提高到38.7%，幼鼠卵母細胞囊胚發育率還是低于成年鼠。

②將胱氨酸和半胱胺濃度提高1倍后（200μmol/L、400μmol/L），性成熟前后卵母細胞發育能力沒有繼續得到提高，幼鼠囊胚率24.0% Vs 27.8%，成鼠為38.7% Vs 38.2%，幼鼠卵母細胞發育能力顯著低于成年鼠。

③添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）能顯著提高處理PMSG的性成熟前后小鼠卵母細胞發育能力，囊胚發育率幼鼠從40.9%提高到51.7%，成鼠從43.8%提高到60.2%。

（八）添加胱氨酸和半胱胺對性成熟前后小鼠卵母細胞胞質中GSH含量的影響

由表1-13我們得出，添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）能顯著提高性成熟前后小鼠卵母細胞胚胎發育能力，將濃度增加1倍后（200μmol/L、400μmol/L），性成熟前后卵母細胞發育能力沒有繼續得到提高，卵母細胞發育能力的提高是否與卵母細胞胞質中GSH含量的變化有關？我們檢測了添加胱氨酸和半胱胺后，性成熟前后小鼠MⅡ期卵母細胞胞質中GSH水平。結果表明（表1-14），幼鼠添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）后，卵母細胞胞質中GSH含量顯著增加，添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）后，GSH水平沒有繼續得到顯著增加；成年鼠添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）后，卵母細胞胞質中GSH含量沒有顯著提高，添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）后，GSH含量顯著增加，添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）及胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）的卵母細胞胞質中GSH水平沒有顯著差異；添加胱氨酸和半胱胺前后，性成熟前小鼠卵母細胞胞質中GSH水平都顯著低于成年鼠；注射PMSG的小鼠，添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）后，性成熟前后小鼠卵母細胞胞質中GSH水平都顯著提高。

（九）性成熟和促性腺激素對性成熟前后小鼠卵母細胞谷胱甘肽合成途徑酶表達的影響

GSH合成途徑有兩種酶，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCL）和GSH合成酶（GSS），其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶有催化亞基（GCLC）和調節亞基（GCLM）組成，分別由不同的mRNA編碼，催化亞基催化半胱氨酸和谷氨酸結合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，調節亞基沒有催化活性，但能與催化亞基結合，調節催化亞基的催化效率，調節反應速度。本實驗取性成熟前后小鼠GV期卵丘卵母細胞復合物，檢測GSH合成途徑中的酶表達。

總RNA的提取與檢測：經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA的完整性和純度均符合反轉錄的要求，結果如圖1-3所示，清晰可見5S、18S、28S三條條帶。經紫外分光光度計測定，所提取的總RNA在260nm的紫外吸收值與280nm的紫外吸收值比值均在1.8～2.0間，說明無蛋白質和其他雜質污染。因此，提取的總RNA質量完好，可用于進一步RT-PCR和定量PCR。

定量PCR標準曲線、溶解曲線、擴增曲線的獲得：試驗采用相對定量比較ct值法檢測mRNA的含量，圖1-4是持家基因GAPDH標準曲線制作圖，可以看出倍比稀釋的各點成一直線，擴增效率99%，擴增曲線（圖1-5）顯示擴增產物呈S形曲線，檢測到熒光信號峰值較高，熔解曲線（圖1-6）為銳利的單峰，沒有雜峰，說明檢測的ct值可靠。

1.GSH合成酶（GSS）mRNA表達

以反轉錄產物作為模板，使用特異性引物進行擴增，PCR產物經1.5%瓊脂糖電泳檢測。電泳結果顯示目的基因cDNA的擴增能獲得特異性產物，其擴增片段長度為122bp，GAPDH擴增片段長度為244bp。結果表明，性成熟前后小鼠卵母細胞GSS mRNA表達沒有差異（1 Vs 2.11，T檢驗），注射PMSG后顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細胞GSS mRNA表達，幼鼠由1提高到19.59，成鼠由2.11提高到36.2，成鼠和幼鼠之間沒有差異（T檢驗）（圖1-7、圖1-8）。

2.谷胱甘肽還原酶（GSS）mRNA表達

以反轉錄產物作為模板，使用特異性引物進行擴增，PCR產物經1.5%瓊脂糖電泳檢測。電泳結果顯示目的基因cDNA的擴增能獲得特異性產物，其擴增片段長度為135bp。結果表明，經T檢驗后，性成熟前后小鼠卵母細胞GCLC mRNA表達差異顯著（1Vs 2.28，T檢驗），注射PMSG后顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細胞GCLC mRNA表達，幼鼠由1提高到8.69，成鼠由2.28提高到11.04，成鼠和幼鼠之間沒有差異（T檢驗）（圖1-9、圖1-10）。

3. γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調節亞基（GCLM）mRNA表達

以反轉錄產物作為模板，使用特異性引物進行擴增，PCR產物經1.5%瓊脂糖電泳檢測。電泳結果顯示目的基因cDNA的擴增能獲得特異性產物，其擴增片段長度為284bp。結果表明，經T檢驗后，性成熟前后小鼠卵母細胞GCLC mRNA表達差異顯著（1Vs 4.55，T檢驗），注射PMSG后顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細胞GCLC mRNA表達，幼鼠由1提高到24.16，成鼠由4.55提高到12.2，成鼠和幼鼠之間沒有差異（T檢驗）（圖1-11、圖1-12）。

（十）體外成熟小鼠卵母細胞最佳SrCl₂激活濃度的研究

為了使體外培養的小鼠卵母細胞獲得較高的孤雌激活率及囊胚發育率，本研究對孤雌激活最佳SrCl₂濃度進行了篩選。選擇注射PMSG的成年鼠體外成熟24h的卵母細胞，結果表明，30mmol/L SrCl₂濃度激活率最低78.1%，囊胚發育率為0，都顯著低于其他濃度；20mmol/L SrCl₂濃度得到的激活率和囊胚發育率最高（97.7% Vs 25.9%）（表1-15）。

（十一）性成熟和促性腺激素對小鼠卵母細胞孤雌激活后胚胎發育能力的影響

體外成熟24h的性成熟前后小鼠卵母細胞，用濃度20mmol/L的SrCl₂激活，然后進行胚胎培養。結果表明（表1-16），3周、4周和6～8周小鼠卵母細胞，不管是COCs還是DO，成熟率和孤雌激活率都沒有差別；孤雌激活后的囊胚發育率不管是COCs還是DO，3周都顯著低于4周和6～8周，4周和6～8周囊胚發育率沒有顯著差別。COCs囊胚發育率分別為3周5.8%、4周11.1%、6～8周13.5%，DO囊胚發育率分別為3周0%、4周4.1%、6～8周5.6%，4周（27～28d）小鼠卵母細胞發育能力和成年鼠沒有差異，說明已經接近性成熟。

（十二）性成熟前后小鼠卵泡和卵母細胞發育同步化程度

卵泡和卵母細胞發育同步化程度，反映顆粒細胞增殖程度和卵母細胞生長同步化程度以及能否用卵泡大小判斷卵母細胞發育能力（Lucas等，2003；Grazyna Ptak，2006）。我們選擇300μm以上的卵泡，測量卵母細胞直徑，結果表明，幼鼠和成年鼠卵泡和卵母細胞發育同步化程度相近（r=0.45Vs r=0.56），且性成熟前后小鼠卵母細胞直徑沒有差別（77.78±0.56μmVs 77.06±0.71μm），卵泡直徑也沒有差別（358.5±6.1μmVs 353.6±7.8μm）（圖1-13）。

四、討論

（一）性成熟和促性腺激素對小鼠卵母細胞體外發育能力的影響

卵母細胞發育能力是指卵母細胞經成熟、受精或者孤雌激活后發育到胚胎特定時期的能力，本文主要研究發育到早期囊胚的能力。利用幼畜體外成熟卵母細胞能夠最大限度地縮短世代間隔，加速品種改良。雖然利用性成熟前動物體外成熟、受精卵母細胞已經成功地獲得了后代（Revel等，1995；O’Brien等，1997；Khatir等，1998a；Ptak等，1999），但是性成熟前動物卵母細胞發育能力比成年動物差，得到的胚胎移植后胎兒死亡的比例高，死亡原因不得而知（Seidel等，1971；Pinkert等，1989；Eppig等，1992；Revel等，1995；Damiani等，1996；Khatir等，1996；O’Brien等，1996；1997，Ledda等；1997，Izquierdo等，1999；Wu等，2007）。在小鼠上我們證明，核成熟率沒有差別這與以前報道小鼠和其他物種的結果相一致（Wu等，2007），不論是體外受精還是孤雌激活后的囊胚發育率幼鼠都顯著低于成年鼠，4周（27～29d）小鼠卵母細胞發育能力顯著高于3周小鼠，達到了成年鼠水平，3～4周齡卵母細胞發育能力迅速提高，這與Eppig and Schroeder（1987）發表的未處理促性腺激素的小鼠卵母細胞隨著年齡增長（16～28d）、卵母細胞發育能力逐漸提高的結論一致。去除卵丘細胞對卵母細胞發育能力的影響，性成熟前后裸卵母細胞發育能力也存在差異。

激素處理能夠提高性成熟前卵母細胞發育能力在多種動物上得到了證明，也有一些文章認為激素處理對卵母細胞發育能力沒有作用或有副作用。促性腺激素能夠增加大的有腔卵泡的數量，引起卵泡顆粒細胞增殖，誘導LHR的合成和類固醇生成酶的表達，調節卵泡內的激素微環境。促性腺激素對卵母細胞發育能力的作用有兩種說法，一種認為促性腺激素作用于卵泡顆粒細胞，誘導信號，增加細胞內cAMP水平（Loutradis等，1987，1994），通過縫隙連接傳遞給卵母細胞，cAMP是一種重要的信號分子，調節卵母細胞成熟（Tsafriri等，1972），卵母細胞體外成熟由于脫離了卵泡內的抑制環境，使細胞核成熟早于細胞質成熟，核質成熟不同步，增加細胞內cAMP水平，能抑制卵母細胞核提前成熟，使細胞質有足夠的時間完成成熟，改善卵母細胞發育能力。另一種認為激素能夠直接作用于卵母細胞，因為在倉鼠的卵母細胞上發現了促性腺激素受體。我們的實驗結果表明，性成熟前后小鼠注射PMSG后，COCs經體外受精和孤雌激活后以及DO孤雌激活后，卵母細胞發育能力都得到了顯著改善，幼鼠卵母細胞發育能力達到了成年鼠水平。

（二）性成熟及促性腺激素對小鼠卵母細胞體外受精后多精受精情況及正常受精受精卵原核直徑的影響

性成熟前動物卵母細胞體外受精后多精受精比例高于成年動物在豬、山羊、綿羊等動物都有證明（O’Brien等，1997）。多精進入會引起胚胎染色體異常，從而導致胚胎死亡。多精受精發生的原因是卵母細胞胞質成熟不完全，透明帶異常。卵母細胞胞質中的皮質顆粒參與阻止多精受精，卵母細胞成熟不夠會造成皮質顆粒釋放障礙，引起多精受精，與成熟的卵母細胞相比，未成熟卵由于不能發生完善的皮質反應和透明帶反應呈現較高的多精受精率。我們的實驗結果證明：性成熟前后小鼠卵母細胞經體外受精后，精子入卵率沒有差別，注射PMSG能顯著提高精子入卵率；多精受精比例幼鼠顯著高于成鼠，且幼鼠多精受精沒有形成原核的比例顯著高于成年鼠，這在性成熟前山羊上也有相同的報道（A.Martino等，1994；Mogas等，1997）。

精子進入卵母細胞后，卵母細胞中形成雄原核生長因子（MPGF），MPGF可能是像核質素（nucleoplasmin）一樣的物質，是精核去致密所必需的。維持雌、雄原核形成所必需的物質，其數量是有限的，當精子進入卵中之后，精核和卵核則競相爭奪這種原核形成物質。在小鼠和大鼠，精核比卵原核對原核形成物質具有更大的親和力，因此，雄原核比雌原核大，但其他動物則不是這樣。多精子進入卵母細胞后，同時競爭原核形成物質，使原核直徑變小。原核直徑和卵母細胞發育能力具有相關性，可以用來判定體外受精后胚胎質量及發育潛力。我們的結果表明：體外受精后兩原核受精卵原核直徑和成鼠相比雖然沒有顯著差異，但也略低于成鼠。PMSG處理顯著提高了性成熟前后小鼠卵母細胞正常受精的比例，原核直徑也有顯著的提高，幼鼠受精卵原核直徑達到了成年鼠水平。這些結果表明，多精受精是幼鼠卵母細胞發育能力差的一個因素。注射PMSG能夠降低多精受精的發生，可能與促性腺激素能夠延遲核成熟，使細胞質成熟充分有關。

卵母細胞在成熟過程中，皮質顆粒向皮質遷移，完成核成熟、到達MⅡ期時，CGs沿質膜下呈線狀排列，（Cran等，1989；譚景和，1995）。外排的皮質顆粒內容物中含有蛋白酶或糖苷酶，可溶解透明帶ZP₃（糖蛋白）而阻止多余精子與透明帶相結合，避免多精受精的發生（譚景和，《脊椎動物比較胚胎學》）。皮質顆粒遷移不完全或提前發生胞吐，都會引起多精受精的發生。我們的實驗結果表明：卵母細胞成熟后，幼鼠皮質顆粒遷移不完全比例顯著高于成年鼠，這也是幼鼠卵母細胞體外受精后，多精受精比例高，發育能力低的原因。注射PMSG后，顯著提高了皮質顆粒遷移完全的比例，幼鼠和成鼠沒有差別，皮質顆粒提前胞吐的比例，在性成熟前后和PMSG處理前后都沒有差別。

（三）性成熟及促性腺激素對小鼠卵母細胞胞質中GSH含量的影響

在觀察多精受精時我們發現，幼鼠卵母細胞經體外受精后，精子去凝集形成原核的比例顯著低于成年鼠，注射PMSG后顯著提高了原核形成的比例。說明多個精子進入同時競爭雄原核形成物質，導致精核不能去凝集。精子細胞核的解聚需要精子細胞核中二硫鍵的還原來誘導。GSH提供啟動雄原核形成之前染色質解凝聚所需的還原基團，另外，GSH還有抗氧化，維持減數分裂紡錘體形態，細胞膜穩定等作用。因此我們測定了性成熟前后小鼠卵母細胞內的GSH水平。結果表明，體外成熟后，幼鼠卵母細胞胞質中的GSH含量顯著低于成年鼠，注射PMSG后顯著提高了胞質中GSH的含量，幼鼠GSH含量達到成年鼠水平。這與Ulrike Luderer（2001）報道的注射PMSG后提高了大鼠卵巢中GSH含量的結果相一致。

谷胱甘肽的合成需要兩種酶三種底物，兩種酶分別是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，三種底物是胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺。細胞培養液中半胱氨酸迅速氧化成胱氨酸。進入細胞后，迅速被還原為半胱氨酸（Bannai and Tateishi，1986）。TCM199中的半胱氨酸含量很低（0.6μmol/L）且十分不穩定，易被氧化成為胱氨酸，這樣就可能會使GSH合成受阻。TCM199中胱氨酸的含量相對較高（83.2μmol/L），有實驗證明象半胱胺和β-巰基乙醇這樣的低分子量的巰基物質能夠通過還原胱氨酸為半胱氨酸，并促進細胞對半胱氨酸的利用來促進GSH合成。半胱胺能增加半胱氨酸吸收，現在已經證明牛（de Matos等，1995）、豬、水牛、山羊、綿羊（de Matos等，2002）和小鼠（de Matos等，2003）等在卵母細胞體外成熟過程中添加半胱胺能促進細胞內GSH合成，幫助入卵精子解聚和雄原核形成，進而提高胚胎發育水平。

我們向成熟培養液中添加半胱胺和胱氨酸（100μmol/L、200μmol/L）能顯著提高性成熟前后卵母細胞的發育能力，這與本實驗室之前報道的提高成年鼠卵母細胞發育能力的結論相一致。但性成熟前后小鼠卵母細胞發育能力還有差別，幼鼠卵母細胞發育能力還是比成鼠差。于是我們將濃度增加1倍，濃度分別為半胱胺200μmol/L和胱氨酸400μmol/L，這時卵母細胞發育能力沒有繼續得到改善，性成熟前后卵母細胞發育能力還是存在差別，我們檢測了半胱胺和胱氨酸濃度分別為200μmol/L、400μmol/L時，卵母細胞胞質中的GSH含量，發現幼鼠顯著低于成鼠（0.64μmol/L±2.3μmol/L和2.10μmol/L±0.3μmol/L），說明在底物充足的情況下，幼鼠卵母細胞合成GSH的能力顯著低于成年鼠。這一結果與2003年Matos報道的結果相一致（Matos等，2003）。于是我們檢測了GSH合成途徑中酶的mRNA表達，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶包括催化亞基（GCLC）和調節亞基（GCLM），是谷胱甘肽合成途徑中的限速酶，分別由不同的mRNA編碼，催化亞基催化半胱氨酸和谷氨酸結合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，調節亞基沒有催化活性，但能與催化亞基結合，調節催化亞基的催化效率，調節反應速度。有報道表明，添加BSO（抑制GCL活性）能顯著降低谷胱甘肽的合成，增加了顆粒細胞凋亡和卵母細胞碎裂。在卵巢中健康卵泡Gclm表達水平高，而閉鎖卵泡GCLM表達量低，排卵前促性腺激素刺激使得膜細胞GCLM顯著增加，促性腺素處理后GCLC和GCLM水平增加，GCL酶活性增加，使得卵巢GSH合成顯著增加（Luderer U等，2001）。我們的結果表明，幼鼠卵母細胞中GCLC和GCLM mRNA水平顯著低于成鼠（T-test），谷胱甘肽合成酶表達兩者之間沒有差別，但也略低于成鼠。注射PMSG顯著提高了這三種酶的表達。

（四）性成熟前后小鼠卵泡和卵母細胞發育同步化程度

卵母細胞發育能力是隨著卵泡和卵母細胞生長發育逐漸獲得的。在這一過程中，卵母細胞存儲RNA和蛋白質，細胞核發生GVBD，染色質凝集，第一極體排出，以及M-Ⅱ抑制，卵胞質發生細胞器重排，MAPK和MPF活性變化，Ca²⁺釋放機制等變化。卵泡直徑和卵母細胞直徑是衡量卵母細胞質量的一個指標，大卵泡獲得的卵母細胞發育能力顯著高于小卵泡，（Furher F，1989），卵母細胞直徑越大，發育能力越強。有報道表明，22天和26天小鼠卵母細胞發育能力有顯著差異，取相同大小的22天和26天小鼠卵母細胞體外受精后，26天小鼠卵母細胞發育能力顯著高于22天，這說明卵母細胞獲得發育能力是與卵泡發育有關的。26天小鼠卵母細胞隨著直徑的增加發育能力增加（Eppig等，1992）。卵泡和卵母細胞發育同步化，反映顆粒細胞增殖程度和卵母細胞生長同步化程度和能否用卵泡大小判斷卵母細胞發育能力。以前的報道表明豬和綿羊性成熟后卵泡細胞和卵母細胞發育才同步化，性成熟前羊卵母細胞和卵泡發育同步化沒有成年羊好（0.11 Vs 0.61）。我們在小鼠上的研究表明，性成熟前小鼠卵泡和卵母細胞發育同步化程度與成鼠相差不多（0.45 Vs0.56）。而且，我們用于做發育實驗的卵母細胞都是來自于大于300μm的卵泡，這部分卵泡所取得卵母細胞直徑在性成熟前后也沒有差別（性成熟前卵子直徑：77.78μm Vs 成年：77.06μm）。由此，我們得到結論，幼鼠卵母細胞發育能力差，不是因為幼鼠卵母細胞直徑小及卵丘細胞數量少導致的。

五、結論

①幼鼠卵母細胞發育能力比成年鼠差，去除卵丘細胞對卵母細胞發育能力的影響，裸卵卵母細胞發育能力在性成熟前后也有差別，4周小鼠卵母細胞發育能力接近于成年鼠水平，注射PMSG后顯著提高了性成熟前后卵母細胞發育能力，幼鼠卵母細胞發育能力達到了成年鼠水平。

②體外受精后，性成熟前后小鼠卵母細胞精子穿透率沒有差別，多精受精率幼鼠顯著高于成年鼠，而且幼鼠的多精受精沒有形成原核的比例顯著高于成年鼠。正常受精的受精卵，雌雄原核直徑平均值，性成熟前后卵母細胞沒有差別。促性腺激素能提高性成熟前后卵母細胞正常受精的比例，雄原核形成比例，以及正常受精受精卵的原核直徑。

③體外成熟后，幼鼠卵母細胞皮質顆粒遷移不完全比例顯著高于成年鼠，4周小鼠與3周小鼠沒有差別，和6～8周小鼠也沒有差別。注射PMSG后，顯著提高了皮質顆粒遷移完全的比例，3周和6～8周小鼠卵母細胞沒有顯著差異，提前胞吐的比例在性成熟前后及注射PMSG前后都沒有差別。

④體外成熟后，性成熟前后卵母細胞胞質中GSH水平，幼鼠顯著低于成年鼠，注射PMSG后，顯著提高了性成熟前后卵母細胞GSH水平，幼鼠達到了成年鼠水平。

⑤成熟培養液中添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）能提高性成熟前后卵母細胞發育能力，增加濃度（200μmol/L、400μmol/L）沒有繼續改善卵母細胞發育能力，向PMSG處理組卵母細胞的成熟培養液中添加胱氨酸（200μmol/L）、半胱胺（400μmol/L）顯著提高了卵母細胞發育能力，成鼠顯著高于幼鼠卵母細胞的囊胚發育率。

⑥GSH合成途徑中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的兩個亞基，催化亞基（GCLC）和調節亞基（GCLM）在性成熟前后有顯著差別，谷胱甘肽合成酶表達兩者之間沒有差別，但也略低于成鼠。注射PMSG顯著提高了這三種酶的表達。

⑦卵泡和卵母細胞直徑以及發育同步化程度不是性成熟前小鼠卵母細胞發育能力差的因素。

⑧小鼠體外成熟卵母細胞SrCl₂最佳激活濃度為20mmol/L，這一濃度的孤雌激活率和囊胚發育率最高。

（曹新燕）