第二節　發酵工業培養基的設計

一、發酵培養基設計的目的

不同微生物對培養基的需求是不同的，不同的發酵生產所需要的原料也不同。工業生產上選用的培養基，必須根據生產菌的營養特性和生產工藝的要求來進行選擇。一個合適的培養基，應該能夠充分滿足生產菌生長、代謝的需求，能達到高產、高質、低成本的目的，其選擇的一般原則如下：

（1）能夠滿足生產菌的生長、代謝的需要　各種生產菌對營養物質的要求不盡相同，有共性，也有各自的特性，且每種生產菌對營養物質的要求在生長、繁殖階段與產物代謝階段有可能不同。實際生產中，應根據生產菌的營養特性、生產目的來考慮培養基的組成。

（2）目的代謝產物的產量最高　氨基酸發酵生產上，生產菌的氨基酸代謝量與培養基組成有較大關系。在滿足生產菌的生長、代謝需求的前提下，應選擇能夠大量積累代謝產物的培養基，以達到產量最高的目的。

（3）產物得率最高　產物得率高低與生產菌株的性能、培養基的組成以及發酵條件有關，對于某一菌株在某種發酵條件下，培養基的選擇十分重要。底物能夠最大限度地轉化為代謝產物，有利于降低培養基成本。

（4）生長菌生長及代謝迅速　保證微生物在所選的培養基上生長、代謝迅速，能夠在較短時間內達到發酵工藝要求的菌體濃度，并能在較短時間內大量積累代謝產物，可有效地縮短發酵周期，提高設備的周轉率，提高產能。

（5）減少代謝副產物生成　培養基選擇適當，有利于減少代謝副產物的生成。代謝副產物生成量最小，可最大限度地避免培養基營養成分的浪費，并使發酵液中代謝產物的純度相對提高，對產物的提取操作和產品的純度有利，同時可降低發酵成本和提取成本。

（6）廉價并具有穩定的質量　選擇價格低廉的培養基原料，有利于降低發酵生產的培養基成本。同時，也應要求培養基原料的質量穩定。因為工業規模發酵生產中，培養基原料質量的穩定性是影響生產技術指標穩定性的重大因素之一。特別是對于一些營養缺陷型菌株，培養基原料的組分、含量直接影響到菌體的生長，若原料質量經常波動，則發酵條件較難確定。

（7）來源廣泛且供應充足　培養基原料一般采用來源廣泛的物質，并且根據工廠所在的地理位置，選擇當地或者附近地域資源豐富的原料，最好是一年四季都有供應的原料。一方面，可保證生產原料的正常供應，另一方面可降低采購、運輸成本。

（8）有利于發酵過程的溶解氧及攪拌　氨基酸發酵是好氧發酵，主要采用液體深層培養方式，在發酵過程中需要不斷通氣和攪拌，以供給微生物生長、代謝所需的溶解氧。培養基的黏度等直接影響到氧在培養基中的傳遞以及微生物細胞對氧的利用，從而會影響發酵產率。因此，選擇培養基還應考慮這方面的因素。

（9）有利于產物的提取及純化　培養基雜質過多或存在某些對產物提取具有干擾的成分，不利于提取操作，使提取步驟復雜，導致提取率低、提取成本高、產物純度低等。因此，選擇發酵培養基時，也要考慮發酵后是否有利于產物的提取。

（10）廢物的綜合利用性強，且處理容易　提取產物后的廢液是否可以綜合利用，廢液綜合利用的程度直接影響到環境的保護。考慮到環保因素，選擇適合的培養基，使提取廢液的綜合利用變得容易，不但可以減輕廢物處理的負荷，降低廢物處理的運行費用，而且副產品可以產生經濟效益，對降低整個生產成本十分有益。

二、發酵培養基設計的基本原則

1.根據生產菌株的營養特性配制培養基

首先要了解生產菌株的生理生化特性和對營養的需求，還要考慮產物的合成途徑和產物的化學性質等方面，設計一種既有利于菌體生長又有利于代謝產物合成的培養基。

2.營養成分的配比恰當

無論是菌體生長還是代謝產物形成，營養物質之間都應有合適的配比。濃度太低，則不能滿足微生物生長的需要，濃度太高，又會抑制微生物的生長。一般情況下，用于培養菌體的種子培養基營養成分應豐富，尤其是氮源含量宜高，即C/N值低。相反，用于積累大量生產代謝產物的發酵培養基，它的氮源一般應比種子培養基稍低，即C/N值高。當然，若發酵產物是含氮化合物時，有時還應該提高培養基的氮源含量。

在設計培養基時，還應特別考慮到代謝產物是初級代謝產物，還是次級代謝產物。若是次級代謝產物，還要考慮是否加入特殊元素（如維生素B₁₂中的Co）或特定的前體物質（如生產青霉素時，應加入苯乙酸或苯乙酰胺等前體物質）。

在設計培養基尤其是大規模發酵生產用的培養基時，還應重視培養基中各種成分的來源和價格，應該優先選擇來源廣泛、價格低廉的培養基，提倡“以粗代精”“以廢代好”。因此，應針對不同菌株、不同時期的營養需求對培養基的營養物質進行配比。

3.滲透壓

對生產菌株來說，培養基中任何營養物質都有一個適合的濃度。從提高發酵罐單位容積的產量來說，應盡可能提高底物濃度，但底物濃度太高，會造成培養基的滲透壓太大，從而抑制微生物的生長，反而對產物代謝不利。例如，在谷氨酸發酵中，葡萄糖濃度超過200g/L時，菌體生長明顯緩慢。但營養物質濃度太低，有可能不能滿足菌體生長、代謝的需求，發酵設備的利用效率不高。為了避免培養基初始滲透壓過高，又要獲得發酵單位容積內的高產量，目前傾向于采用補料發酵工藝，即培養基底物的初始濃度適中，然后在發酵過程中通過流加高濃度營養物質進行補充。

在設計營養物配比時，還應該考慮避免培養基中各成分之間的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸鹽時，會與培養基中的鈣離子或鎂離子在加熱時發生沉淀反應。在高溫下，還原糖與蛋白質或氨基酸也會相互作用，產生褐色物質。

4.適宜的pH值

各生產菌株都有其生長最適pH值和產物合成最適pH值，為了滿足微生物的生長和代謝的需要，培養基配制和發酵過程中應及時調節pH值，使之處于最適pH值范圍。這是因為微生物在生長代謝過程中營養物質的利用和代謝產物的形成往往會改變環境中的pH值。例如，培養基中的蛋白質或氨基酸經發酵后，會產生氨，從而有升高培養基pH值的趨勢。培養基的滅菌過程也會引起培養基的pH值發生變化。高溫處理過程中，一些大分子發生分解，造成pH值下降。部分微生物生長的最適pH值，見表3-8。

三、發酵培養基設計的方法

培養基的組成必須滿足菌體細胞生長繁殖和產物合成代謝的元素需求，要提供維持細胞生命活動和產物合成代謝所需要的能量。在設計各種培養基（種子培養基、發酵培養基）時，要充分考慮細胞的元素組成狀況。在實驗分析某些細菌細胞的元素組成與培養基中一些元素濃度的相關性時發現，培養基中某些元素如P、K等是超量的，某些元素Zn、Cu等接近最大需求量，P濃度的變化使許多培養液緩沖能力發生變化。細菌、酵母菌和霉菌細胞的元素組成（干重）見表3-9。

對于微生物生長后期能合成某種或某些代謝產物的發酵來說，設計的培養基不僅要考慮細胞組成所需要的元素，而且還要認真分析組成代謝產物的元素種類和數量，同時分析何種營養物質與代謝產物合成有內在聯系。一般來說，設計的培養基應具備這樣的效果：菌體對數生長期開始時，有生理功能的菌體迅速生長繁殖，對數生長期末能迅速轉入代謝產物合成的生產期，并使產物合成速率保持一適宜的線性關系，此種線性關系能維持相當長時間，可獲得最大的產物合成量。

確定一種適合于工業生產的孢子培養基、種子培養基、發酵培養基、補料培養基等，僅僅按照微生物細胞營養元素理論值的條件還不能進行培養基的設計，因為微生物的品系不同，其生理特異性差異較大，產物的合成代謝途徑比較復雜，所以還必須對微生物種類、生理特性、一般營養需求、產物的組成和生物合成途徑、產品的質量要求等進行深入分析。同時，也要考慮所采用的發酵設備和培養條件、原材料的來源等。上述工作完成后才能進行基礎培養基組成的設計。設計的基礎培養基組成要經過一定時間的搖瓶實驗考察，根據菌種的生長動力學、產物合成動力學以及兩者的內在聯系及其與環境條件的關系，進一步修改其組成，使之適合菌體生長和產物合成的要求。

培養基的基本組成確認后，還要進一步考察所選用的原材料的配比關系，發酵培養基的各種原材料濃度配比恰當，既利于菌體的生長，又能充分發揮菌體合成代謝產物的潛力。如果各種營養物質配比失調，就會影響發酵水平。其中碳源與氮源的比例影響最為顯著，碳氮比偏小，能導致菌體的旺盛生長而造成菌體提前衰老自溶，影響產物的積累；碳氮比過大，菌體繁殖數量少，不利于產物的積累；碳氮比合適，而碳源、氮源濃度過高，仍能導致菌體的大量繁殖，增大發酵液黏度，影響溶解氧濃度，容易引起菌體的代謝異樣，影響產物合成；碳氮比合適，但碳源、氮源濃度過低，會影響菌體的繁殖，同樣不利于產物的積累。因此，發酵培養基中的碳氮比是一個重要的控制指標。另外，生理酸性物質和生理堿性物質的用量也要適當，否則會引起發酵過程中發酵液的pH值大幅度波動，影響菌體生長和產物合成。無機鹽的濃度不合適也會影響菌體生長和產物合成。

四、發酵培養基的優化

目前還不能完全從生化反應的基本原理來推斷和計算某一菌種的培養基配方，只能用生物化學、細胞生物學、微生物學等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經驗配方，再結合所用菌種和產品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發酵設備，按照一定的實驗設計和實驗方法篩選出較為合適的培養基。在篩選培養基中使用的原材料種類和濃度配比時，經常采用的方法有單因子實驗法、正交實驗設計、均勻設計和響應面分析等等。

一般培養基設計要經過以下幾個步驟：

①根據前人的經驗和培養要求，初步確定可能的培養基組分用量。

②通過單因子實驗最終確定最為適合的培養基組分。

③當確定培養基成分后，再以統計學方法確定各成分最適合的濃度。

1.單因子實驗

單因子實驗是傳統的有效方法，適用于培養基組成和單一營養成分的選擇。在確認培養基基本組成之后，逐個改變某一種營養成分的品種或濃度進行實驗，分析比較實驗所得的菌種生長情況、碳氮代謝規律、pH值變化情況、產物合成速率等結果，從中確定應采用的原材料品種或配比濃度。單因子實驗法在考察較少因素影響時經常被采用，此法消耗大量的人力、物力和時間，其實驗結果的準確性不同。

2.正交實驗設計

正交實驗設計是根據正交性準則來選擇有代表性的實驗點，這些實驗點具備“均勻分散，整齊可比”的特點，有效地解決了實驗因素較多而產生的多因素完全實施方案過大的矛盾，具體實驗實施時采用規格化的正交表來安排多因素實驗，并對實驗結果進行統計分析，找出最優實驗方案，廣泛應用于科學研究和工農業生產中。采用正交實驗設計可以達到省時、省力、省錢的效果，同時又能保證得到基本滿意的實驗結果。

3.均勻設計

均勻設計和正交實驗設計相比，只考慮實驗點在實驗范圍內“均勻分散”，而不要求“整齊可比”，也是通過一套精心設計的均勻設計表來進行實驗設計。均勻設計實驗結果的統計分析一般采用非線性的二次響應曲面回歸分析，可考察各因素的重要程度和因素間的交互作用。如果符合線性回歸條件，也可采用多重線性回歸分析。回歸分析，不但可以篩選自變量，還可以根據回歸方程找出“最佳組合”，但要注意回歸方程的不可外延性。

4.響應面分析

（1）Plackett-Burman（PB）實驗設計法是主要針對因子數較多，且未確定眾因子相對于響應變量的顯著性而采用的實驗設計方法，可以分清實驗因素對指標影響的大小，找出主要因素，抓住主要矛盾。用此方法可以使實驗次數減少，而影響因素的主要效果得到盡可能準確的估計，能從眾多的考察因素中盡快而有效地篩選出最為重要的幾個因素，以便后面進一步研究。

（2）根據Plackett-Burman（PB）實驗設計找出顯著因素后，安排最陡爬坡試驗，要先逼近最佳區域后再建立有效的響應面擬合方程。最陡爬坡法試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經濟地逼近最佳區域。可以了解實驗因素與實驗指標影響的規律性，即每個因素的水平改變時，指標是怎樣變化的。

（3）Box-Benhnken Design（BBD）法是利用合理的實驗設計并通過實驗得到一定數據，采用多元二次方程來擬合因素和響應面值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優提取條件，解決多變量問題的一種統計學方法。與其他方法相比，BBD實驗減少了實驗次數，周期短，得到的回歸方程精確度高，又能研究好幾個因素之間的交互作用，是解決生產過程中實際問題的一種有效辦法。