第二節　水環境附著生物的研究方法

過去100多年里，附著生物生態學的發展非常迅速，出現了比較新的概念如附著生物景觀，它推動了傳統過程與大尺度景觀生態學的結合，當然也可在微米或毫米尺度應用于附著生物景觀（Battin et al，2007）。過去30年中，附著生物生態學和研究技術的發展是并駕齊驅的，如微電極和光纖技術的出現，使研究者可在附著層內進行精細的生物地球化學剖面研究（K¨uhl ， Polerecky，2008）。聲學和光學速度計技術可用來描述附著生物群落附近和內部的水力條件、去向和來自附著生物的邊界層運輸（Larned et al，2004）。共焦激光掃描顯微鏡通過使在精細尺度上研究完整的附著生物結構成為可能影響了附著生物-景觀研究（Larson，Passy，2005）。20世紀80年代，脈沖-振幅熒光計（pulse-amplitude modulated，PAM）允許生態學家原位測定附著生物群落的光合作用。PAM熒光儀在附著生物生態學中的應用非常多樣，從毒理學到光和養分限制（Vopel，Hawes，2006；Muller et al，2008）均有應用。

一、附著生物成分的分析

附著生物種群和群落的取樣點、取樣時間及功能分析需要科學仔細地設計。采樣點的設置和數量根據調研水體的形態和大小確定，采樣點的選擇要有代表性。采樣的頻率一般每年不少于4次，建議春、夏、秋、冬各1次。

1.附著生物的分離

附著基質不同，附著生物分離的方式也存在差異。附著基質主要有人工基質和天然基質。人工基質主要有玻璃片、聚乙烯片、花崗巖片、聚酯薄膜、人工植物等，天然基質主要有沉積物、石塊、木塊、水生植物、大型水生動物體表、枯木等。使用人工基質應僅限于附著生物的相對比較分析，例如沿污染的梯度。人工基質上的附著生物主要通過多次沖洗、物理剝離（毛刷洗刷、小刀刮）的方法進行，但此類方法也易低估附著生物群落的生物量或物種數，且可能對群落結構產生一定的干擾。目前，超聲處理已發展為一種可取的方法。天然基質上附著生物的分離方法可借鑒人工基質的，但水生植物由于具有生物活性，其上附著生物的分離相對比較煩瑣。一般采用物理方式（劇烈振蕩法、軟毛刷刷取法）并不能完全分離，輔以超聲的效果比較好，尤其是對水生植物上附著細菌的洗脫非常有效。在解離附著生物的過程中，關鍵是要把附著生物有效地從葉片上洗脫下來，同時要避免對葉片組織結構的破壞，以免植物組織的內溶物、內生細菌對結果產生干擾。在無菌水中添加適當濃度的去污劑或者表面活性劑（如Tween80、焦磷酸鈉等），加入pH緩沖液，再輔以超聲、振蕩處理，可以加快附著細菌從植物表面的解離，同時對附著細菌生物膜中的聚集體進行破碎均一化，有利于對細菌多樣性的研究。

2.附著藻類色素的分析方法

附著藻類的色素主要包括葉綠素和胡蘿卜素。附著藻類葉綠素的測定方法中，首先，選擇溶劑很重要。溶劑的選擇取決于取樣群落，主要有丙酮、甲醇、乙醇。其次，提取輔助如研磨、振蕩和超聲波也很重要。目前比較常用的方法是90%丙酮提取法，分光光度法測定。

3.附著藻類和附著原生動物的種類鑒定

分離后的附著生物懸濁液用魯哥試劑固定后，沉淀24h后棄去上清液，定容至30mL，以備附著藻類種類鑒定，加4%的福爾馬林溶液可長期保存。用于鑒定原生動物的懸濁液可不加任何試劑，直接在顯微鏡下觀察，也可直接加魯哥試劑和4%的福爾馬林溶液固定。樣品鑒定一般鑒定到屬或種。

二、附著生物空間結構分析

附著生物通常被定義為所有生活在浸沒在水中的基質表面上的生物群落。為避免誤解，附著生物群落的要素的空間排列應指其結構。各種顯微技術使研究附著生物結構成為可能。光學顯微鏡只能觀測到微界面附著物的表面結構，研究附著生物-附著基質的復雜關系是受限的，但它可以協助檢測微界面附著物的全貌，在此基礎上選擇有代表性的樣品片段進行深入觀測。聲學和光學速度計可用來描述附著生物群落附近和內部的水力條件、去向和來自附著生物的邊界層運輸。后來發展起來的掃描電鏡技術大大促進了人們對微界面結構的了解。普通掃描電鏡必須對植物樣品進行逐級脫水、冷凍干燥和噴金等過程，容易造成植物表面附著物的脫落（Rogers，Breen，1981；Allanson，1973；劉凱輝等，2015）和自然結構的破壞，不能反映微界面附著物表面的真實情況。共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）可在精細尺度上研究完整的附著物結構（Larson，Passy，2005），但需要做切片，易對微界面附著物造成擠壓變形，觀測結果可能與微界面附著物的真實形貌存在較大誤差，亦不能反映微界面的自然結構。近年來發展的基于共聚焦激光掃描顯微術的光譜指紋技術可用于研究微界面附著物的深度剖面和生物監測。用于掃描電鏡的超低溫冷凍制樣及傳輸技術可實現直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。樣品經過超低溫冷凍、斷裂、鍍膜制樣（噴金/噴碳）等處理后，通過冷凍傳輸系統放入電鏡內的冷臺（溫度可至-185℃）上即可進行觀察，其中快速冷凍技術可使水在低溫狀態下呈玻璃態，減少冰晶的產生，從而不影響樣品的自然結構，冷凍傳輸系統保證在低溫狀態下對樣品進行電鏡觀察。冷凍干燥輔助液氮脆斷雖可以完整保存橫截面形貌，但可能造成特定成分變形，而且測試成本較高。環境掃描電子顯微鏡（environmental scanning electron microscope，ESEM），可不對沉水植物進行任何前處理，在環境真空條件下直接分析微界面結構，可更直觀地呈現微界面的真實結構，是研究沉水植物莖葉微界面結構的理想工具。核徑跡纖維放射自顯影法（nuclear track microautoradiographic，NTA）可研究特定養分元素的位置、量化和估計同化速率，用這種方法可估計單個附著生物種群同化的無機和有機碳。應用核徑跡纖維放射自顯影法和粒密度放射自顯影技術（grain-density autoradiographic techniques）可提供附著生物群落內供給動力學和養分同化的信息。

三、附著生物群落結構分析

群落結構知識是解釋其功能特征的基礎，群落結構的量化應通過活體生物量的估計和計算來進行。在分子生物學技術使用之前，研究者們通過分離純培養的方法（如涂平板法）觀察細菌菌落的形態，并且通過不同的特征對細菌進行分類。該研究方法可以獲得微生物菌株本身，并可進一步用于不同培養條件和微生物代謝等方面的研究。但該方法在很大程度上受到菌株分離方法、培養時間、培養基成分等的影響，而且環境中微生物的群落結構非常復雜，物種多樣性極高，能夠通過純培養技術獲得的微生物只占到環境中極少的一部分。現代分子生物學技術克服了傳統純培養技術的上述局限，可以在基因水平上進行細菌種類的鑒定。在原核生物中16 SrRNA基因普遍存在，它包括高度保守的序列區和高變區，是生物的種屬鑒定和系統分類的重要分子基礎，因此，對不同物種的16 SrRNA基因進行比較分析能夠很好地研究生物的親緣關系。研究環境微生物的主要分子技術有群落指紋圖譜方法，包括變性凝膠電泳技術（denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE）、末端限制性片段長度多態性技術（terminal restriction fragment length polymorphisms，TRFLP），此外還有構建細菌克隆文庫、熒光原位雜交（fluorescent in-situ hybridization，FISH）、基于16SrDNA的高通量測序法、基因芯片技術等。隨著分子生物學的快速發展，現代分子生物學手段已經廣泛用于微生物的多樣性以及系統進化關系的研究。

變性梯度凝膠電泳（DGGE）、熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，FISH）和克隆測序等是研究附著細菌群落結構的常規方法，但其分辨率和覆蓋率不足，使用高通量測序技術現已成為一種新趨勢，可對附著細菌的群落結構及多樣性信息進行較全面的研究。二代測序方法以微生物目標基因的PCR產物為樣本進行測序，一個反應得到幾萬至幾百萬條序列，測序的廣度和深度大大提高。Illumina公司的MiSeq測序就是一種高通量的分析方法，能夠全面獲取細菌的群落結構及多樣性信息，并且可以檢測到一些稀有物種。這種測序技術能夠對核酸片段進行深度測序，其技術原理是采用可逆性末端邊合成邊測序反應，在測序速度和通量上有了較大的提升。利用該技術可以對任何物種在DNA水平上進行全基因組測序、基因組靶向區域測序，檢測基因組范圍內的遺傳變異或多態性。高通量測序技術已經廣泛應用于研究微生物的群落結構及微生物的多樣性。高通量列陣（The Access Array 48.48、AA48.48、Fluidigm Corporation、South San Francisco、CA、USA）通過使用陣列芯片，可同時進行2304個PCR的擴增，將樣品定量PCR和序列文庫PCR在一個反應中同時完成，該PCR產物可直接用于二代測序分析，僅需5h，與二代測序相結合，可同時得到微生物的群落組成和豐富度信息，簡化二代測序樣本的制備程序。二代測序的測序廣度和深度較克隆文庫的方法大大提高，尤其是提高了對數量上占少數的微生物群落的覆蓋，不僅能從群落水平上揭示微生物群落組成的變化，而且能從更細的微生物分類水平上顯示微生物群落的具體變化，在環境樣品的16S rRNA、18S rRNA和功能基因的分析中均有應用。

四、附著生物功能分析

附著生物群落是一個功能微系統，它包括同時出現在界面層內的內部自養和異養過程?？蓪⑽⒘考夹g應用于用高分辨率（如氧、pH值的微電極；無機養分的化學分析，同位素示蹤；酶分析）測定庫和過程速率。為有效評價微生物和基質內代謝（水生植物組織和沉積物內）的相互關系，可建立幾個實驗和原位方法。如為使異質性最小和集中分析關鍵機制，可對群落進行分室研究；用簡化的實驗系統可有效地評價一些問題，如實驗室附泥藻類分析中外來有機質負荷的調控將改變泥水界面的氧化還原條件和養分釋放速率；大多數基質是活的，如植物組織或與無機和有機基質組分代謝耦合的陡分層的底棲微生物群落，因此必須充分理解耦合和基質代謝同步，以便定量測定出入附著生物的流通速率；可用綜合參數來分析群落、物種代謝和養分、有機化合物循環。微電極、顯微放射自顯影（microautoradiography）、酶活性等可直接分析群落和物種水平的代謝和養分通量。

分析不同自然狀態（貧營養、富營養、酸化等）和控制條件下重要元素（如碳、氮、磷、硫等）的代謝循環很重要。如P循環對藻類、細菌的分離速率、基質利用和有機、無機形態P的釋放，尤其是光合作用、衰老和吸收的相互作用方面很重要。P較穩定，多數情況下很少釋放到水中?，F代技術如³²P和³³P標記有望解釋這些途徑和快速循環速率。對于N循環，對附著生物群落內和基質界面無機和有機N多種形態的定量方法還沒有統一標準。證據表明，附著生物在調節無機N出入底泥和植物基質的速率、生態系統N固定、來自地下水的溶解性無機或有機N通量極其他過程中極其重要。現代方法（如酶活性、同位素示蹤、代謝終產物分析等）可詳細分析N循環中附著生物的功能。微量有機養分對附著生物群落的重要性目前還沒有較好的測定方法。

附著微生物功能分析常用的方法有穩定同位素標記與微生物DNA或RNA分析相結合的方法、功能基因微列陣、微生物宏基因組和宏轉錄組分析及單細胞水平研究方法等。

FISH技術可確定細胞和組織中特異性轉錄物定位及其表達的相對水平，將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和元素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系，在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。這一技術是用標記生物素或地高辛的非同位素探針和所制備樣本中的RNA進行雜交，將是研究復雜群落環境中原位基因表達較為有利的手段。另外，結合報告基因分析的FISH技術對于復雜微生物群落的結構與功能分析也是十分方便有利的。在微生物群落研究中利用FISH技術將原位雜交與功能研究結合是必然的發展趨勢，可以進行基因表達和代謝水平的研究。

穩定性同位素示蹤DNA/RNA-SIP是研究復雜環境中微生物功能的關鍵技術。其基本原理是利用穩定性重同位素底物（¹³C）原位培養復雜環境樣品，超高速離心即可將¹³C-DNA/RNA與未標記的¹²C-DNA/RNA分離，獲得具有活性的微生物群落DNA/RNA，從而開展下游分析。DNA/RNA-SIP實現了單一微生物向復雜微生物組研究的轉變，為在整體水平系統研究微生物在自然環境中的重要生理過程、定向發掘重要微生物資源和生物技術開發提供了關鍵技術支撐。目前，DNA/RNA-SIP技術在微生物生態學、環境微生物學、地質微生物、海洋微生物、生物地球化學等領域得到了廣泛應用，在元素生物地球化學循環、污染物生物降解過程、腸道微生物生理生態與健康醫學、生物活性物質高通量篩選和合成生物學等方面的應用漸趨成熟，成為未來功能微生物組學研究的重要技術。

穩定性同位素聯合宏基因組技術（SIP enabled metagenomics）可大大減少克隆的數量。通過穩定性同位素（SIP）實驗使參與特定代謝過程（例如反硝化）的生物基因組得到富集，克隆從SIP實驗中獲得的¹³C標記的核酸，從而構建出在某一特定的環境過程中執行特定代謝功能（如可吸收或轉化、代謝特定的標記基質）的環境微生物的功能宏基因組文庫，就可重建一個較小、針對性強的目標微生物功能群基因組，從而極大地減少需要篩選的基因克隆數量，并且可直接利用分離出的¹³C-核酸構建宏基因組克隆文庫。將DNA-SIP與宏基因組學結合技術可以幫助我們在種群水平解決目標微生物的功能問題，這一技術發展非常迅速，其中包括在宏基因組學上應用細胞分選和微流體技術，在單細胞染色體組方面應用激光拉曼光譜顯微鏡技術，在熒光原位雜交上應用等離子聚焦光譜測定技術以及放射自顯影技術。穩定性同位素聯合宏基因組技術可用于環境甲基營養菌（甲烷營養菌和甲醇營養菌）、有機污染物降解菌、根際微生物生態（植物、微生物、微動物相互作用）、厭氧環境中互營微生物等群落結構和特定代謝過程的功能分析，在微生物的種類鑒定和功能鑒定間建立了直接的聯系。

微陣列（DNA microarray）也叫寡核苷酸陣列（oligonucleitide array），是一種研究有多少基因能相互作用以及一個細胞網如何同時控制大量基因的新方法。該技術的原理是在固體表面上集成已知序列的基因探針，被測生物細胞或組織中大量標記的核酸序列與上述探針陣列進行雜交，通過檢測相應位置的雜交探針，實現基因信息的快速檢測。微陣列技術已廣泛應用于研究廢水處理系統以及環境污染物中微生物參與的反應和調節過程及機制、營養物循環和富營養作用的微生物多樣性、微生物生態學原理以及生物學過程中與環境脅迫反應相關的基因功能和調節控制研究，并建立了基因表達譜，特別是寡核苷酸微陣列是當前環境微生物群落功能研究中的一種有效手段。常用的微列陣有系統發育芯片（PhyloChip）（用于識別微生物以及微生物之間的系統發育聯系，分析微生物的多樣性）和功能基因芯片（GeoChip）（用于研究功能基因的多樣性和功能微生物的活性）。

GeoChip是一種高通量基因芯片，可用于分析微生物群落，并研究其群落結構對生態系統的作用。該高通量基因芯片包括了編碼參與主要地球化學循環（如碳循環、氮循環、金屬抗性、有機物降解、硫循環和磷循環等）的微生物酶類的寡聚核苷酸探針。盡管基因芯片在基因表達研究中是一個強大的工具，但是，將其運用到環境微生物研究領域仍然存在著很多挑戰，諸如探針設計、基因序列覆蓋范圍、特異性、敏感性和定量。為了解決這些問題，一種特殊的基因芯片即功能基因芯片應運而生并被廣泛應用。功能基因芯片包含了涉及微生物所參與的各種過程的主要編碼酶的基因序列的探針，它在將微生物多樣性和微生物功能聯系在一起的研究領域非常有用，因為基因芯片涵蓋了功能已知的基因。在已知的基因芯片中，GeoChip是在生物地球化學、生態學和環境分析中最適用的，包括涉及碳循環、氮循環、磷循環、硫循環、各種金屬抗性、抗生素抗性、有機污染物降解和能量傳遞等基因探針，并且有基于gyrB的系統發育分析標記。當前的GeoChip版本包括70000個功能基因，超過400種功能基因類別。陽性控制來自于核糖體基因，陰性控制來自于人類、植物和超嗜熱菌基因。

微生物的基因組和轉錄組，即提取一種已知生物的DNA或RNA，不進行目標片段的PCR擴增，隨機打斷成幾百個堿基的片段進行測序，得到全面的遺傳信息，也稱為鳥槍測序法。與基因組學和轉錄組學不同的是，宏基因組學和宏轉錄組學反映的是多種生物或環境中整個群落的特征，包含環境微生物的全部遺傳信息，相比于16 SrRNA，除了群落中各種微生物群落的分類信息外，宏基因組學更是包含了所有微生物的基因信息，有助于對微生物群落的潛在功能進行深入分析。宏基因組學和宏轉錄組學呈現的是多種生物或環境中整個群落的特征，包含環境微生物的全部遺傳信息。與穩定同位素標記相結合，較其他微生物多樣性分析的方法，宏基因組學可以更全面地反映代謝特定底物的微生物的信息。