第三章　骨及軟骨組織工程和軟組織生理及修復　Bone and Cartilage Tissue Engineering ＆ Soft Tissue Physiology and Repair

華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院　鄭啟新

第一節　骨組織工程學　Bone Engineering

由于創傷、疾病或者其他因素等所致的組織、器官(包括骨、軟骨)缺損或者功能喪失嚴重影響人體生活質量甚至威脅生命。目前多用自體、異體或者異種組織或者器官移植來治療，也有用人工組織或者器官，但是這些組織或者器官存在來源有限、免疫排斥反應或者無生物活性等缺點。為了解決人體組織、器官缺損修復的難題，醫學及材料學領域的專家進行了不斷地探索。1987年美國材料專家Langer和Vacanti提出了“組織工程學”的概念，即在一種有良好生物活性的支架材料上種植人體活細胞，在生長因子作用下生長成為有生物活性的組織或者器官。組織工程的概念是應用生命科學和工程學的原理和技術，構建一個有生物活性的組織，植入人體內修復組織缺損，重建組織或者器官的功能;或者作為體外裝置，暫時替代器官功能，以提供生存質量。組織工程學理論是“復制”組織或器官，解決組織和器官缺損的難題，是一場有意義的醫學革命。它研究的主要內容包括:種子細胞、支架材料和細胞生長因子(圖3-1-1)。

支架材料

組織工程支架材料是指能與組織活體細胞結合，為細胞提供生長空間并能植入生物體的材料，它是組織工程的最基本框架。組織工程支架材料必須具備良好細胞相容性(即能與細胞直接結合)和組織相容性(即與植入生物體結合)，同時，它還必須具備足夠的力學性能(強度、彈性等)、適當的結構(三維空間結構，如海綿狀或纖維網狀，其孔隙率和孔徑合適)和生物穩定性(對非降解材料要求植入后保持穩定的結構和組織結合能力，對可降解材料則要求其降解產物無局部或全身毒副作用)。因此，組織工程支架材料在使用前必須經過嚴格的理化性能和生物相容性檢測。

目前骨組織工程支架材料主要包括:高分子材料、無機材料、天然生物材料和復合材料。

(一)高分子材料

1.聚乳酸(PLA)

由丙交酯開環聚合而成。植入體內后能逐漸降解生成乳酸，參與機體代謝，最終生成H2O和CO2而排出體外。PLA有L-聚乳酸、D-聚乳酸和DL-聚乳酸三種異構體，三者的理化性能有差別。

2.聚羥基醋酸(PGA)

由乙交酯開環聚合而成，降解速度比PLA快，降解后生成羥基醋酸，也參與機體代謝。

3.PLA和PGA共聚物

為了改變單一聚合物的降解速度和機械性能，常將PLA和PGA復合成共聚物，改變材料的分子量及組成成分，以調節其理化性能。PLA/PGA共聚物是目前臨床上應用廣泛的可降解植入材料之一。由這種材料制成的海綿狀支架具有良好的三維空間結構，為骨細胞提供適宜的生存空間，同時可提供所需的形態，構建組織工程骨。

(二)無機材料

無機材料主要包括陶瓷、玻璃、碳纖維及復合材料。其中應用最廣泛的是陶瓷材料。陶瓷材料分為:生物惰性陶瓷(乳氧化鋁陶瓷)、生物活性陶瓷(羥基磷灰石陶瓷)、生物降解陶瓷(β-磷酸三鈣)。

1.生物惰性陶瓷在材料結構上穩定，具有較高力學性能，植入機體后缺乏生物活性，與機體組織內有一層結締組織相隔，結合性差。

2.生物活性陶瓷中含有鈣、磷等元素或羥基等基團，植入骨組織后，其表面與組織接觸能通過代謝或元素置換與機體骨組織達到鍵合，X線衍射顯示材料中的化學性羥基磷灰石與骨組織中生物性羥基磷灰石結合。材料與骨組織間無其他組織。

3.生物降解陶瓷主要為磷酸三鈣，植入機體內后可通過體液的溶解和巨噬細胞降解的機制被逐漸吸收而被替代。

生物陶瓷具有良好的生物相容性和較高強度，可制成多孔海綿狀結構，與人體骨結構相似，在骨組織工程中應用廣泛。

(三)天然生物材料

1.同種或異種骨

經過凍干、脫鈣、煅燒、脫蛋白等處理后，同種或異種骨(主要是松質骨)保持原有三維孔狀結構，可作為骨組織工程支架材料(圖3-1-2)。

2.膠原

是一種蛋白質，廣泛存在于人和脊椎動物的結締組織中。提取的異種膠原具有良好生物相容性和降解性。降解產物無明顯的毒副作用。膠原可制成膜狀或海綿狀材料作為支架材料。

3.甲殼素和殼聚糖

來源于動物的天然多糖。可制成纖維狀、膜狀或海綿狀，可完全水解。

(四)復合材料

復合材料是由兩種或者以上不同材料優化組合而制成的支架材料，充分發揮各類材料的優點。常用的材料有:

1.陶瓷材料與聚合物的復合 如PLA與HA或TCP的復合，這樣當PLA降解時，HA或TCP可以緩解植入局部的酸性環境，同時復合材料中降解的鈣和磷可參與新骨形成。

2.PLA和PGA的復合 這種復合材料可調控降解速度和力學性能。

支架材料的組織相容性和表面活性

與細胞的直接結合是支架材料的最基本特征，材料必須為細胞的附著和生長提供良好的生物界面，而目前常用的支架材料所提供的生物界面尚不能令人滿意。因此，對材料表面進行改性是組織工程研究的主要領域之一。常用的表面改性方法有表面修飾法、化學改性法、雜化改性法、等離子體噴壁法等(圖3-1-3)，其中表面修飾備受關注，它是通過在材料表面固定一些細胞因子或者改變材料表面的局部結構而提高材料的細胞相容性(圖3-1-4)。

(一)在生物材料表面固定蛋白質進行表面修飾

在材料表面固定蛋白質最簡單的方法是物理吸附，其吸附力依靠離子鍵、疏水作用或范得華力。一種比較可靠但較復雜的方法是通過化學鍵共價固定蛋白質。這種共價固定方法通常是以雙功能交聯劑(如硅烷、氧化硅基連接劑)為中介，交聯劑的一端通過硅烷醇鍵連接在金屬或玻璃表面，另一端有一可變的懸吊基團結合蛋白質。有些學者利用具有高度親和力的配體，通過受體-配體反應固定蛋白質，如:植物血清素、抗生物素蛋白、蛋白G、蛋白A。通過配體固定蛋白質類似于共價鍵固定。

到目前為止，蛋白質的固定方式主要集中在二維模型。光阻技術、光化學技術、自聚集形成單層有機膜技術等蛋白質固定方法已得到廣泛應用。

1.光阻技術

光阻技術以硅烷為偶聯劑，將蛋白質固定在二氧化硅或金屬表面。首先在底物表面離心鑄造一層光致抗蝕劑，再覆蓋一層掩膜，紫外線輻射使光致抗蝕劑分解，暴露底物的特定區域。氨基硅烷(促進黏附)可與這些已暴露的區域結合。然后用丙酮對作底物進行聲處理，除去剩余的光致抗蝕劑，暴露底物的剩余區域，可以與甲基或烷基硅烷(疏水性或抑制黏附)結合。由于硅烷末端懸吊基團的不同，與不同的蛋白質結合產生異源性單層界面或蛋白質的特定結合區域。這種方法可以減少蛋白質的非特異性吸附;但殘余溶劑和光致抗蝕劑可以使蛋白質變性，降低蛋白質的活性。

2.光化學技術

該技術固定蛋白質是利用化學不穩定性物質，在紫外光輻射時被激活，可結合目標分子的特性。通過光化學技術固定蛋白質有以下四種方式:

(1)將結合有光化學物質的底物在蛋白質溶液中孵育，紫外光輻射，被激活的光化學物質與溶液中的蛋白質結合。

(2)底物先與光化學物質孵育，然后用紫外光輻射，激活光化學物質，其一端與底物結合，另一端的懸吊基團與蛋白質結合。

(3)將帶有“籠子基團”的底物用紫外光照射，除去“籠子基團”，暴露底物的活性區域，結合蛋白質。

(4)將底物與含有幾種光化學物質的交聯聚合物以及蛋白質溶液共同孵育，紫外光照射，被激活的聚合物能結合底物和蛋白質，將蛋白質固定在底物表面。光化學技術與傳統的蝕刻技術相比，它所用的溶液、緩沖液及反應試劑對蛋白質的活性影響較小;而且，在同一底物表面，這些化學物質可被重復利用固定多種蛋白質。

3.自聚集形成單層有機膜技術(SAM)

當烷基硅烷或鏈烷巰基分子在二氧化硅或金屬表面時，它們能自聚集形成單層有機膜。分子鏈的一個端基與底物表面結合，另一個端基呈游離狀態。反應端基的變化和單層有機膜的連接反應或表面能也發生變化，從而在表面制成混合性有機單層，蛋白質可以固定在親水性或促進黏附的單層有機膜上。

隨著蛋白質固定技術的發展，蛋白質定位和蛋白模型技術正受到大家的關注。這兩個方面的發展也促進了免疫診斷學和生物傳感技術的進步。作為蛋白質固定學科新的分支，納米模型和三維蛋白固定技術已成為廣大學者研究的主題。

(二)在生物材料表面固定氨基酸及其衍生物進行表面修飾

對于有些細胞，材料表面固定氨基酸單分子聚合物，如聚賴氨酸和聚鳥氨酸，可以增強細胞的黏附性。在材料表面固定的氨基(模擬肝素結合肽的活性)，可以與細胞膜表面的蛋白多糖結合，促進細胞的黏附。多聚鳥氨酸和三鳥氨酸含有豐富的帶電基團，將其固定在材料表面，增加材料的表面電荷濃度，提高細胞的黏附力。另有研究表明，將帶正電荷的賴氨酸和精氨酸殘基固定在材料表面，在熱滅活牛血清白蛋白存在條件下能增強人包皮成纖維細胞的黏附能力。總之，通過固定氨基酸可以提高材料的表面電荷濃度，增加黏附細胞的數量和增強細胞的黏附力。

(三)在生物材料表面固定多肽進行表面修飾

組織工程中將多肽固定在生物材料表面，制成受體專門性材料，可促進受體介導的細胞對材料的黏附來提高其生物相容性，促進細胞黏附、擴展。多肽固定在材料表面通過兩種方式:共價鍵和非共價作用。共價鍵的形成一般包括材料表面的反應部分和氨基酸側鏈或氨基、羧基末端。各種不同的技術已經被用來將多肽共價固定在材料表面。如:將多肽GRGDY共價固定在聚(乳酸-共-賴氨酸)表面，可以促進牛動脈內皮細胞擴展。一些物質，如白蛋白，本身沒有黏附活性，但容易吸附在材料表面，而多肽又容易和白蛋白共價結合;所以將多肽-白蛋白復合物吸附在材料表面，對材料進行表面改性。還有學者將疏水性氨基酸結合到多肽末端，然后再吸附到材料表面。羥基磷灰石是一種植入材料，它本身不支持細胞附著，但羥基磷灰石的鈣可以與Asp或Glu的羧基結合。Fujisawa等人根據這一特性設計了富含酸性氨基酸Glu的仿生肽Glu7-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr，將其吸附在羥基磷灰石表面，改變它的生物相容性，實驗證明可以促進成骨細胞的附著與擴展。

Robin A等學者將PLA熔化，制成PLA膜。通過固相化學法合成保護性GRGDS肽，以1-乙烯-3-(3-二胺丙基)碳化二亞胺(EDC)和1-eq N-羥琥珀酰亞胺(NHS)作為偶聯劑，聚賴氨酸(PLL)與保護性GRGDS肽結合。除去PLL-GRGDS的Boc末端基團及側鏈上的保護性基團。PLL-GRGDS可結合到PLA表面。異雙官能反應物Sulfo-LC-SPDP的N-羥琥珀酰亞胺基團和膠原單體的胺基反應生成穩定的酰胺鍵，它的2-吡啶基二硫化物基團和GRGDSPC肽的半胱氨酸殘基的硫氫基反應形成二硫鍵。所以，以Sulfo-LC-SPDP為中介可以將GRGDSPC肽固定在膠原表面。在硅烷的無水己烷溶液中，硅烷與二氧化硅共價結合，異雙官能交聯劑N-琥珀酰亞胺-3-馬來酰亞胺丙酸(SMP)的一端與硅烷結合，另一端的馬來酰亞胺基團與半胱氨酸殘基的硫氫基共價結合，這樣含RGD序列和半胱氨酸殘基的細胞黏附肽就共價固定在二氧化硅底物表面。

在材料表面固定多肽可以增強它的生物相容性，促進種子細胞附著、擴展、細胞骨架的組織以及局灶黏附的形成。通過固定RGD肽進行表面修飾的材料能顯著增加細胞運動的持續時間。G.Maheshwari等人將YGRGD肽固定在無黏附活性的材料上，制成具有不同的表面配體濃度及不同的簇狀空間分布特征，觀察NR6成纖維細胞的黏附、移動情況，結果發現NR6成纖維細胞的移動速率依賴于配體空間分布。在相同的表面配體濃度時，簇狀固定的YGRGD肽更能提高NR6成纖維細胞的移動速率;而非簇狀固定的YGRGD肽即使在最高的表面配體濃度時，也幾乎不支持NR6成纖維細胞的移動。而且，固定的RGD肽能與細胞膜表面的受體-整合素特異性結合;整合素是一種跨膜蛋白，由α亞單位和β亞單位構成的異二聚體，激活后可以調節跨膜信號以及胞漿內信號的傳導。但是，將多肽固定在材料表面可由于空間阻礙而降低肽的活性。添加氨基酸殘基或其他基團，或將多肽固定材料上也會改變肽原來的功能，表現為肽活性的降低，所以在固定多肽時應注意添加基團的溶解度、復合物的二級結構、三級結構改變以及空間阻礙效應。

種子細胞

在組織工程研究中，種子細胞決定組織工程化材料的性質，掌握種子細胞的分離、培養、生長調控技術和建立標準種子細胞系，了解培養細胞的形態、功能、培植是十分重要的。目前骨種子細胞的來源主要有骨、骨膜、骨髓、骨外組織和早期胚胎，其中多為骨膜來源的成骨細胞和骨髓間充質干細胞。

骨膜來源的成骨細胞用兩種培養方法獲得:一是酶消化法，即將骨膜剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化30分鐘，0.1%膠原酶適度消化，然后收集細胞培養;二是組織塊培養法，即將骨膜剪碎成約1mm× 1mm×1mm大小塊狀，放入培養瓶內，加入培養液和血清，在37℃、5%CO2環境中培養，待成骨細胞從骨膜邊緣長滿后去除組織塊，用胰蛋白酶消化再傳代培養。

骨髓間充質干細胞(MSC)的培養是通過穿刺或者沖洗骨髓腔獲得骨髓，通過加入分離液和離心獲得細胞懸液，然后逐漸隨換液去除懸浮生長的造血細胞而得到骨髓間充質干細胞。在培養液中分別加入維生素C、β甘油磷酸鈉、地塞米松和1，25-(OH)2維生素D可以誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化。

骨髓間充質干細胞因其具有干細胞的特征，在體外培養中具有較強的增殖能力和多向分化潛能，且自身取材容易，因此在骨組織工程中具有廣闊的應用前景。目前研究主要集中在對MSC的分離純化、大規模培養和調控方面。

(一)MSC分離培養的細胞免疫學基礎

相差顯微鏡觀察發現體外培養MSC團與成纖維細胞類似，進一步研究其細胞周期發現所培養的MSC中約10%處于S期、G2期和M期，其余90%則處于G0期、G1期。盡管到目前為止還不能確定細胞周期中每一期的檢測點和長短，但G0/G1期占整個細胞群的比例達90%則說明了MSC的高分化潛能。傳代培養時，MSC表現出了高度的擴增能力，且仍保持著細胞的染色體核型和端粒活性。

許多實驗室研究表明MSC能表達多種表面抗原。1991年，Simmon等發現鼠IgM單克隆抗體STRO-1不與CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix等造血定型祖細胞作用;骨髓單核細胞中形成CFU-F的均為STRO-1+細胞;長期體外培養發現STRO-1+細胞具有多分化潛能，并對體外培養的造血細胞起支持作用。1992年，Haynesworth等用人骨髓基質細胞免疫小鼠篩選出3個雜交瘤系SH2、SH3、SH4，其產生的抗體識別人MSC，但不與骨髓造血系細胞、骨髓基質成纖維細胞反應，也不與成骨細胞和骨細胞反應。1999年Pittenger等用流式細胞儀對培養的人MSC進行鑒定，發現培養至14天的MSC仍為SH2、SH3陽性，而CD14、CD34、CD45等造血系標志檢測為陰性。1997年，Joyner等用單克隆抗體Hop-26選擇骨髓單核細胞，發現Hop-26可與0.59+/－0.27%的單核細胞結合，但不與造血系細胞、成骨細胞、脂肪細胞及纖維組織等作用，免疫檢測發現Hop-26特異性地結合CFU-F。

其他的學者也相繼發現抗Sca-1、麥胚凝集素、大豆凝集素、抗MAB1470，抗α-平滑肌肌動蛋白(時間依賴性)等可以和BMSC親和。另外，MSC還可以表達細胞因子(IL-1α、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、SCF、LIF、M-CSF等);細胞因子受體(IL-1R、IL-3R、IL-7R、G-CSFR、PDGFR等);黏附分子(整合素亞基　α3、α4、α5、β、整合素　αvβ3、αvβ5、ICAM-I、CD44等);細胞外基質(Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型膠原等)，但這些抗原或是具有間質細胞的抗原特征，或是具有上皮細胞、肌細胞的特征，無特異性。

早期的學者認為培養的MSC具有同質性，然而，隨著研究的深入，越來越多的學者趨向于異質性的觀點，認為培養的細胞由未定型間充質干細胞和定型間充質干細胞組成。在MSC培養過程中，如用5-FU抑制細胞生長，即可發現培養的細胞群中存在少量處于G0/G1期的靜息細胞亞群。該群細胞體積小、呈非顆粒狀(RS-1)，細胞RNA含量低，不與細胞周期特異性抗原Ki-67作用，形成克隆能力差，且高水平表達ODC抗酶基因。Colter等在培養中發現，除了成熟的骨髓基質細胞(mMSC)和RS-1以外，極低密度傳代時，細胞群中可見到另外一群體積小、呈顆粒狀的細胞。RS-2直徑約7μm，核/漿比例高。在對數生長期，RS-2數量減少，RS-1數量增加，mMSC則迅速擴增。出現這種現象的一種可能是滯留期RS-1生成RS-2，對數生長期RS-2生成mMSC，對數生長期末RS-2再生成RS-1;另外一種可能是mMSC生成再循環干細胞(RS cells)。

最近Colter等又利用流式細胞儀對RS細胞和mMSC可能的多種表面抗原進行了研究，發現RS細胞可特異表達或部分表達VEGFR、TRK(C-14)、轉鐵蛋白受體、脂調素-2、CD-4、CD-107、CD-117等，而mMSC則特異表達或部分表達CD-10、CD-147、STRO-1、PDGFR、EGFR等。它們雖都可以表達脂調素-5、HLA-1、CD31、CD38、CD44、CD49e、CD59、CD81、CD90等抗原，但無特異性。實驗中還發現RS細胞和mMSC均不表達CD1a、CD11B(Mac-1)、CD14、CD27、CD34、CD43、CD45和CD133等造血系細胞表面特異性抗原。

(二)MSC的分離

常用的分離MSC的方法有全骨髓法和離心法。全骨髓法即根據干細胞貼壁特性，定期換液除去不貼壁細胞，如造血系細胞、內皮細胞等，達到分離純化干細胞的目的。離心法即根據骨髓中細胞成分比重不同，提取單核細胞進行貼壁培養。盡管Prockop觀察認為造血系細胞在培養過程中不貼壁死亡或隨換液棄去，2～3周可以消失，但Kitano在實驗中發現，造血系細胞存在可達2個月之久。另外，由于CFU-F細胞在全骨髓中比例很低，約每10萬個有核細胞中含有1個，單純采用以上方法難以獲得純的MSC。

隨著對MSC表面抗原認識的深入，有人利用免疫方法如流式細胞儀法、免疫磁珠法等對其進行分離純化。1994年，Vlasselaer等用流式細胞儀分離MSC，發現其出現在FSChigh-SSChigh部分，這部分細胞經Sca-1抗體和麥胚凝集素再次選擇，經選擇細胞出現在Sca-1+和麥胚凝集素高親和部分，可分化為成骨細胞，表達堿性磷酸酶。但經分選的細胞成骨活性低。培養發現分選的細胞中大多數不貼壁，并在24小時內死亡，可能是分選過程中機械剪切力和高能激光造成了MSC的損傷，并影響了其生化特性。1999年，Encina等用抗STRO-1包被的免疫磁珠從人的骨髓基質中分離出間充質祖細胞，繼續培養，其中98%的細胞分化為成骨細胞，表達堿性磷酸酶，產生骨鈣素，礦化。最近，Oreffo用Hop-26選擇分離人骨髓基質細胞，培養第8天發現CFU-F中61%～77%的細胞為Hop-26+，第11天見有大量的克隆形成，呈典型的成纖維細胞樣，傳代培養并未改變Hop-26+細胞的增殖能力，經地塞米松等誘導可表達成骨標記。

(三)MSC的二維培養

1.低氧張力下的培養

機體外部環境中的氧張力(約140mmHg)多顯著高于哺乳動物組織中的氧張力，如人動脈血氧張力為95～100mmHg，骨髓中氧張力為27～49mmHg，相當于氧濃度的4%～7%。盡管機體內存在谷胱甘肽過氧化物酶，超氧化物歧化酶，過氧化氫酶等保護因素，但當機體內氧濃度異常增高時，細胞及組織功能不可避免地受到損害，因此，可以設想，在體外進行細胞培養時，如氧濃度低于20%，則會更有利于細胞功能的存留。

20世紀90年代初期Deren等在體外采用低氧張力培養牛骨膜細胞，不僅細胞增殖速度得到明顯提高，而且細胞堿性磷酸酶的表達也大大增強。后來，Lennon等在體外培養鼠MSC時，將95%空氣、5%CO2和5%O2、5%CO2、90%N2兩種培養條件進行對比研究，發現實驗組原代培養中MSC的貼壁率及存活力提高，克隆數明顯高于對照組。相差顯微鏡觀察發現實驗組第一代培養中細胞克隆大，克隆數量多，且克隆數多少并未影響細胞增殖速度。另檢測發現第一代培養中細胞堿性磷酸酶的表達增強，原代培養中的細胞則更趨向于成骨和成軟骨。

2.極低密度傳代培養

不同的實驗室在進行MSC培養時細胞傳代密度有所不同，盡管均可獲得在外部形態上都成紡錘形的成纖維細胞塊，且都具有多分化潛能，但是彼此間的擴增速度、擴增倍數以及所得細胞群的異質性均存在較大差異。大多數實驗室認為高密度傳代培養細胞生長緩慢，通常的解釋是培養過程中細胞與細胞間的接觸抑制，但是否由于培養的細胞在培養過程中分泌的某種物質導致這一結果，尚在進一步的探索之中。

Bruder等采用較低密度(5000/cm2)傳代培養人MSC時，發現兩周左右細胞集落融合，細胞數擴增3～5倍。有研究發現，極低密度(0.5～12/cm2)傳代更有利于細胞增殖。在0.5～12/cm2范圍內，盡管每100個細胞所形成的克隆數相同，但克隆的大小卻截然不同。對比發現，1.5/cm2或3.0/cm2傳代培養所形成的克隆大，10天左右細胞擴增2000倍，對數生長期12小時即擴增一倍;而6/cm2或12/ cm2傳代培養所形成的克隆小，其中12/cm2傳代10天僅擴增60倍左右，對數生長期倍增時間為24個小時。另外，實驗中還發現，按1.5/cm2密度傳代培養可持續傳代50代，而按5000/cm2密度傳代培養僅傳代15代。

最近，Javazon等又對極低密度下人與鼠MSC的培養進行對比研究，結果表明:①后者對極低密度傳代培養更敏感。同等密度(2/cm2)傳代12天，前者細胞擴增2000倍，而后者細胞擴增達4000倍。②細胞擴增更迅速。③培養過程中須頻繁更換培養液。④細胞擴增時形成融合。⑤成熟的骨髓基質細胞能產生RS細胞和單細胞源性克隆。認為兩者差異的原因可能是:自鼠取得的骨髓樣本中本身已含有較多的祖細胞;鼠MSC在培養過程中已發生轉化。

(四)基因轉染的MSC培養

對MSC進行細胞學研究，發現它是一種相對靜止、更新率低的群體，外源基因導入后可以持續表達較長時間，一些學者試圖通過對轉染了篩選基因的MSC進行培養，從而達到純化該細胞的目的。

Kitano等以反轉錄病毒為載體，攜帶LacZ和neo基因靶向體外培養的鼠MSC，經G418篩選后的細胞在原代培養中形成了大的成纖維細胞克隆，檢測未發現造血系細胞的污染，細胞表達低水平的分化標記，但仍保持原始表型，保留著向脂肪細胞和成骨細胞分化的潛能。在實驗中，Kitano還發現運用不同的包裝細胞，所得的實驗結果也不一樣。分別用ψ-CRIP和ψ-CRE培養的上清液處理人MSC后，前者形成的克隆數為70.3個/1×107，其中8.3個為大克隆(＞700個細胞)，后者形成的克隆數僅為3.1個/1×107，且均為小克隆(＜20個細胞)。另外，基因轉染原代培養過程中，第1、2、5天分別開始用G418進行篩選，結果表明第1、2天開始篩選所得的細胞形成的克隆大，第5天開始篩選所得的細胞分化潛能低下，且形態多變，認為細胞的篩選應在基因轉染的早期進行。

(五)MSC的三維培養

二維培養技術已普遍應用，盡管逐步得到改善，但仍存在難以克服的缺陷。

1.貼壁的表面積有限，細胞產量低。

2.無菌操作過程煩瑣，容易污染。

3.代謝產物逐漸積累，排除不及時易引起細胞生長不良甚至退化。

4.細胞離開了體內同細胞外基質共同構成的三維立體結構，生物學行為受到影響，容易變異。

因此，有人提出三維培養的設想。1998年，Qiu對鼠骨髓基質細胞進行三維培養，掃描電鏡檢測發現微載體cytodex-3表面大量細胞覆蓋，并相互橋接在一起，組成了三維多細胞聚合物。聚合物中可見礦化結節，免疫組織化學染色可見堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原。Glowacki用膠原海綿作為載體進行三維灌注培養，減少了代謝產物的聚集，結果發現細胞外基質含量提高，所培養的細胞活性和功能均加強。但cytodex-3和膠原海綿均為實心載體，表面積比較小，細胞難以大規模擴增。

(六)存在問題與展望

MSC體外培養的研究已進行30余年，取得了很大的進展，但由于其本身的研究還不系統全面，仍處于探索階段，有些問題亟待解決。

1.MSC培養過程中的異質性，影響了干細胞分離純化的效果 如何有效地獲得大量同質性的MSC，有待于對其細胞學特點和異質細胞群中各類細胞標志物的進一步研究。

2.對MSC在細胞工程和組織工程方面的利用研究，都希望得到大量的未分化干細胞成分 理論上講，在體外設法誘導或用外源基因導入等技術，可使干細胞實行對稱性有絲分裂，無限擴增而不分化，但其結果是細胞形態和生理可能發生改變。

條件永生化基因的引入或許會克服這一困難。1998年，Hicok將SV40的變異型溫敏基因tsA58導入MSC，形成了細胞的條件永生化，即在34℃環境下，細胞能持續增殖，分化受到抑制;在39.5℃環境下，細胞增殖減慢，出現分化，且在不同的誘導條件下，或表達成骨標記，或表達成脂標記。但是，長期培養發現這些細胞并不能保留其分化能力，可能是細胞永生化的逆轉受到了抑制。如何避免擴增的干細胞朝多方向分化，仍有待于研究。

3.基因轉染的MSC的培養為我們獲取純的干細胞提供了新的空間，但轉染的外源基因是否會影響MSC的分化潛能，純化后的MSC長期傳代能力如何，目前尚存爭議Kitano在實驗中發現原代培養的細胞分化潛能下降、傳代培養所形成的克隆數減少。而Oreffo在體外長期培養(＞9個月)基因轉染的MSC，發現其仍具有良好的分化潛能，注入鼠皮下后，可在骨組織中檢測到含有標記基因的MSC，并最終分化為成骨細胞。另外，如何提高基因轉染效率也是一個需要進一步研究的問題。

生長因子

促進成骨的生長因子有很多，通常存在于骨基質中，參與骨的改建和修復。在骨組織工程研究中，這些生長因子可以與支架材料復合，在體外構建組織工程化骨(圖3-1-5)，促進種子細胞增殖或植入骨缺損區內，修復骨缺損。

(一)骨形態發生蛋白(BMP)

BMP能誘導間充質細胞(或干細胞)分化成成骨細胞或軟骨細胞。將BMP與磷酸三鈣陶瓷人工骨復合后植入小鼠背部肌帶4周時可有新骨在支架材料內形成。植入到兔橈骨骨缺損區后其修復效果明顯優于對照組。

(二)轉化生長因子β(TGF-β)

在骨和血小板中含有量最為豐富，可調節骨代謝、促進成骨細胞的增殖，但是其生物活性可能有種屬特異性。

(三)成纖維細胞生長因子(FGF)

對成骨細胞具有促進增殖的作用，促進新骨形成。

(四)血小板源性生長因子(PDGF)

可促進成骨細胞的有絲分裂，同時對成骨細胞有較強的趨化作用。

(五)胰島素樣生長因子(IGF)

可刺激成骨細胞分裂，增加成骨細胞數量，同時可促進骺板的成骨作用。

(六)表皮生長因子(EGF)

可增加成骨細胞活性和膜內成骨過程。

組織工程化骨的構建及應用

組織工程化骨的構建有兩種方法:一是將支架材料與成骨因子在體外復合培養后植入骨缺損區，通過成骨因子的信號的作用下植入區來源的成骨細胞形成新骨(即細胞因子型組織工程)，如將多孔材料TCP陶瓷與BMP復合后植入骨缺損區(圖3-1-6)。另一種方法是通過體外下分離培養技術獲得足夠數量的成骨性種子細胞，與支架材料在體外復合后直接植入或者培養一段時間后再植入骨缺損區(即細胞型組織工程)。支架材料上也可以預先吸附生長因子(如BMP、TGF-β1等)。

作者的研究小組進行了組織工程化骨構建的系列研究:①將牛BMP與磷酸三鈣陶瓷復合構建成復合材料植入家兔的橈骨骨缺損中，8周左右缺損修復，效果優于單獨植入磷酸三鈣;②將含鋅煅燒骨、多孔TCP陶瓷、脫蛋白骨等與MSC體外復合培養72小時后植入裸鼠肌肉內，4周是發現植物內有新骨形成。取新鮮的小牛骨松質骨部分，鋸成骨條，放入水中，煮沸，部分脫去骨中的有機質。將骨條植入氫氧化鈉、過氧化氫溶液中浸泡以進一步去除有機質，置干燥箱中干燥。然后放入電爐中煅燒，緩慢升溫至800℃，維持6小時。將煅燒后的骨條浸入焦磷酸鈉溶液中，水浴，干燥，進行第二次煅燒，緩慢升溫至1200℃，維持1小時。制備成經兩次煅燒的牛松質骨。測定其主要成分為β-磷酸三鈣，抗壓強度和抗折強度分別為(3.84±0.40)MPa和(3.92±0.29)MPa，掃描電鏡下材料微孔互相交通，孔徑200～850μm。含鋅煅燒牛松質骨是根據材料的率，將單純煅燒骨100g浸于500ml 0.25mol/L的氯化鋅溶液中，60℃水浴1小時，干燥后再經1200℃高溫煅燒，制成含鋅(0.4%wt)煅燒骨。取新西蘭大白兔自雙側股骨大轉子部穿刺抽取骨髓。加入基礎培養基(DMEM，10%小牛血清)，放在培養箱中培養(5% CO2，37℃)。4天后全量換液，PBS漂洗，除去紅細胞及未貼壁細胞。以后根據細胞生長情況及培養基顏色換液，大約3天換液1次，細胞長滿瓶底后0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。繼續用誘導培養基(基礎培養基;β-甘油磷酸鈉10mol/ml、L-維生素C 50μg/ml、地塞米松10～8mol/L)培養，使細胞向成骨細胞分化。細胞堿性磷酸酶染色ALP染色后，誘導培養組細胞胞漿內見大量黑色或褐色顆粒沉淀。鈣化結節茜素紅染色和四環素熒光染色:染色顯示有較多的深紅色礦化結節，散在分布，形態各異。反射熒光顯微鏡下，礦化結節呈強烈的金黃色熒光改變。復合培養1周掃描電鏡觀察，細胞均勻地分布在煅燒骨表面及孔洞內，與煅燒骨表面貼附緊密。4周時，新生骨沿煅燒骨表面排列，內部孔隙可見類骨基質沉積，成骨細胞較多，某些部位可見軟骨樣組織形成。8周時，見大量新骨形成，充滿煅燒骨的孔隙，為板層骨，有成骨細胞和骨陷窩，周圍有大量骨基質。

目前組織工程化骨已經初步應用于臨床修復骨缺損。隨著種子細胞的培養及調控、支架材料的研制、支架材料與種子細胞相互作用等問題的解決，組織工程化骨可能大規模用于臨床。

組織工程化骨的血管化

骨是一種微血管網十分豐富的器官，因此構建組織工程化骨應具備良好的血管網，以給種子細胞傳輸營養物質和排出代謝產物，以便保持組織工程化骨的正常活性。組織工程化骨血管網的建立是一個復雜的過程，與支架材料、種子細胞和生長因子都密切相關。

組織工程的支架材料不僅是要起著細胞的黏附、增殖、分化的支架的作用，而且要有合適的三維結構，有利于營養物質和氧氣的滲透交換，為新生血管長入提供通道，并可作為生長因子緩釋劑的載體(圖3-1-7)。

為有利于內皮細胞的黏附和新生血管的長入，骨組織工程的支架材料必須滿足一定的要求，首先要有良好的生物相容性，包括表面相容性和結構相容性。Rubin等證明生物惰性但表面相容性和結構相容性差的聚乙烯材料，不論其形狀大小、植入時間長短、是否應用促進血管形成的因子，在血管長入方面都明顯比HA對照組要差。而且所用材料的性能和孔隙比具有促血管形成的生長因子bFGF對血管生長的影響更大。Pieper等在膠原材料中加入骨基質成分糖胺聚糖(硫酸乙酰肝素和硫酸軟骨素)，在植入體內2、4周時可減少材料周圍的異物反應和促進血管形成。其原因是生物材料良好的生物相容性和生物活性可以減少植入體內時的異物反應，而異物反應的炎性細胞的作用和形成的纖維包膜對血管的長入是不利的，同時糖胺聚糖等物質可能為血管的形成提供信號。

載體材料還要有合適的三維結構，一般現在對組織工程材料的要求是孔隙率90%以上，孔徑100～500μm，孔隙交通，材料隨新生組織長入逐步降解，降解速度和組織新生的速度匹配，這些都有利于血管的長入。Kuboki Y等研究表明多孔HA材料促進血管化和成骨細胞的黏附、增殖、分化的最佳孔徑是300～400μm。在孔徑90～120μm的HA中先誘導軟骨形成然后再骨化，而大于350μm的HA中可以直接誘導骨組織形成。這個最佳孔徑就是最適合血管長入的孔徑范圍。

在骨的生長和改建中有一個復雜的通訊網絡起作用，其中包括有內皮細胞、成骨細胞、破骨細胞、巨噬細胞、基質細胞等，通過這個網絡傳導全身系統信號和局部信號對生理變化起反應。骨的微血管在這個過程中起中樞的作用，調節骨的細胞的生理反應。

在組織工程化骨的構建中，血管內皮細胞和成骨細胞的聯合培養優于成骨細胞的單獨培養。實驗證明成骨細胞和內皮細胞間共同培養時，在細胞的調控和功能上相互促進，這是因為細胞有旁分泌作用。Villars等把成骨前體細胞(人骨髓基質細胞: HBMSE)單獨培養或者和內皮細胞(人臍靜脈細胞: HUVEC)按不同的方式混合培養(直接或非直接接觸)，實驗表明，HBMSC合成和表達VEGF，對HUVEC培養起促進作用，并且當HBMSC和HUVEC直接接觸培養時ALP的活性提高，這表明兩種細胞間不僅存在分泌的細胞因子的相互作用，還涉及細胞膜蛋白的細胞間通訊的直接作用。

新生血管需要內皮細胞生長，內皮細胞可取自血管的內皮，也可以由骨髓基質細胞分化而來。Hattori等在鼠的骨髓基質中培養出內皮細胞，用RT-PCR方法驗證了存在VEGF的受體VEGFR-1，2，Tie-1，2和von Willebrand factor(馮·威利布蘭德因子，VWF)，并且轉導入ts-SV40 T-antigen基因形成了永生化內皮細胞系。

骨髓基質細胞含有數種前體細胞，能分化成內皮細胞，并且能分泌促血管生長因子，如VEGF、bFGF，在大鼠的角膜模型中植入骨髓基質細胞可見血管形成。用骨髓基質細胞分離、培養內皮細胞和促進血管形成的效果是肯定的。目前，已經有人用直接注射自體骨髓基質細胞的方法治療心肌缺血，并且已經進入臨床試驗階段。

由此考慮，在骨組織工程的種子細胞的選擇上，利用骨髓基質細胞，使之定向分化為成骨細胞和內皮細胞，并使二者相互促進發揮作用，可能是一個有前景的研究方向。

生長因子在血管化過程中起著重要作用。促進血管形成的生長因子有VEGF，FGF，BMP，TGF-β等。

血管內皮細胞生長因子(VEGF)在血管形成中是一個基本的調節因子，它在胚胎的血管形成過程中是必不可少的，并且為長骨生長和軟骨化骨所需。VEGF可以強烈地刺激內皮細胞分裂增殖，促進血管形成。很多細胞包括成骨細胞可以合成分泌VEGF。

堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是骨和軟骨組織中的一種成分，它可以促進成骨細胞和軟骨細胞的分裂增殖，在培養中抑制軟骨細胞的最終分化。在異位成骨中，bFGF可以通過增加受體床的新生血管形成改善血供條件，并且能幫助多能性間充質細胞趨化和增殖。

Leunig等通過實驗研究bFGF的作用，在體外，bFGF抑制軟骨細胞的分化，降低軟骨板的生長速度，但是在鼠皮下植入的體內實驗中，bFGF通過促進血管化加快新骨的形成，這也從另一方面說明了血管化對新骨的形成的作用。

關于TGF-β和BMP的促血管形成作用有爭論，Suwa等認為BMP加入到HAP中可以顯著地刺激新血管形成，逐漸形成豐富的血管網包裹HAP，加速骨缺損的愈合，而且HA復合BMP可以顯著刺激未分化的間充質細胞分化為成血管內皮細胞和成骨細胞。但是Levine和Yamashita等認為BMP對血管形成只有輕微或沒有作用。Cheung WH等認為在骨骺板中的TGF-β1有抗血管形成作用，并且其抗血管形成作用可以用抗TGF-β1抗體來消除。但Ramoshebi等發現用TGF-β1可以使雞的尿囊絨膜上有明顯的血管形成。

血管的形成是多種因素共同作用的結果，單獨大劑量地使用某一種促血管形成的生長因子如VEGF可能形成血管瘤或有缺陷的血管組織，聯合應用多種生長因子不僅有助于正常血管組織的形成，而且因子間會有協同作用。Ramoshebi等發現單獨用大劑量的TGF-β1(20ng)，bFGF(500ng)或BMP-7(1000ng)可以在雞的尿囊絨膜上有明顯的血管形成，聯合應用低劑量的TGF-β1(5ng)，bFGF(100ng)和BMP-7(100ng)同樣有明顯的血管形成，而單獨使用某種小劑量的細胞因子時血管明顯減少。這些表明生長因子間對血管形成有協同促進作用。

促血管形成的生長因子的使用和其他的局部應用的調節因子一樣，在使用的過程中應該保持足夠的局部濃度和作用時間，并且釋放平穩。因此促血管形成的生長因子的局部緩釋使用應該是最好的選擇。Elcin等用殼聚糖-白蛋白微球作為載體制作ECGF緩釋劑，在體外3周時仍可保持(0.5 wt%)/ day的平穩釋放，植入大鼠腹股溝區7天后有大量的新生血管形成，對照組(直接注射ECGF)在同等時間無明顯新生血管形成。

生長因子也可以通過基因轉染技術，將促血管的生長因子轉入種子細胞，使種子細胞能持續地自動產生高效能的生長因子。

在動物體內預制血管化組織工程骨的試驗中，常用的方法是把材料植入到血管網周圍或將血管埋植入材料中，利用自身血管長入材料。Alam等硅樹脂制成下頜骨形狀，從中間剖開，裝載骨基質材料和rhBMP-2，植入鼠的大腿內側，將包含隱靜脈的肌蒂夾在材料中。4周后可形成外形和下頜骨一樣的帶血管蒂的肌骨瓣，組織學顯示材料內新骨形成，有豐富的血管網。

體外構建血管化骨比較復雜，目前進行了一些試驗探索。Frerich等將骨髓基質細胞在體外擴增，種植到微載體上。將微載體置入含內皮細胞的纖維基質上，在體外培養。6周后顯示毛細血管樣結構增加到140mm/mm3。進一步的試驗表明，高壓氧可以明顯增加毛細血管樣結構的形成。

利用顯微制造技術和計算機輔助設計、計算機輔助制造技術在體外合成血管化組織是組織工程的一個新的發展方向。Carnegie Mellon大學正在進行這方面的研究。基本原理是利用顯微制造技術在薄膜材料上根據組織特異性構建出相應的材料結構，如毛細血管的溝槽和骨小梁結構，再種上相應的細胞，如血管內皮細胞和成骨細胞，然后將多層薄膜層疊固定，制造出含血管網的骨組織。

第二節　軟骨組織工程學　Cartilage engineering

支架材料

目前軟骨組織工程支架材料主要包括人工合成高分子材料、天然高分子材料和復合材料。

(一)人工合成高分子材料

PLA、PGA以及PLGA等人工合成高分子材料均具有生物可降解性、可塑性好。PLGA為PLA和PGA的共聚物，高度多孔的PLGA泡沫能為軟骨細胞提供三維生長空間，是一種理想的支架材料。

(二)天然高分子材料

殼聚糖、藻酸鹽、纖維蛋白凝膠、瓊脂糖凝膠、透明質酸、膠原、明膠、膠原明膠、膠原海綿、膠原-糖胺聚糖復合物等天然高分子材料均可作為軟骨組織工程支架，其中膠原和纖維蛋白的應用較為廣泛。

(三)復合材料

常用的復合材料有:

1.天然材料與人工合成高分子材料的復合如殼聚糖與PLA、PGA的復合。

2.天然材料與天然材料的復合 如膠原與殼聚糖的復合，這種復合材料可調控降解速度和力學強度。

隨著分子自組裝、納米技術的發展，自組裝多肽材料也開始應用于軟骨組織工程支架的研究。這種材料在一定條件的水相環境中可以形成一定形狀的三維支架材料，可以通過注射技術運送到體內，其降解性好，降解產物為氨基酸單體，可以作為生物體營養物質的來源，很少引起毒副作用及免疫反應，從而成為一種新型的軟骨組織工程支架材料。

種子細胞

軟骨組織工程種子細胞主要有:軟骨細胞、骨髓間充質干細胞和胚胎干細胞。

(一)軟骨細胞

軟骨細胞是軟骨組織中單一細胞成分，軟骨細胞的分離來自軟骨。在無菌條件下取出關節軟骨、骺軟骨或肋軟骨，用PBS漂洗3次，然后將軟骨切成薄片，再將軟骨片剪成1～2mm3大小的碎塊，用0.25%胰蛋白酶按10∶1比例加入消化30分鐘，吸去胰蛋白酶按10∶1比例加入Ⅱ型膠原酶消化4～6小時。為避免膠原酶對細胞的毒性作用，可在此階段采用分階段收集分離的軟骨細胞。分離出的軟骨細胞用PBS或Hank液漂洗3次，制成細胞懸液，然后加入培養液接種在培養瓶上，在37℃5%CO2條件下培養。

采用單層培養(二維培養)的軟骨細胞經過傳代后其形態和功能將發生一系列變化，Ⅱ型膠原蛋白分泌減少，增殖能力逐漸下降。Benya等于1982年發現軟骨細胞在瓊脂糖凝膠三維環境中能夠保持表型穩定和未分化狀態，三維環境有利于軟骨細胞增殖、分化、表型穩定和基質合成，這促進了軟骨組織工程的發展。為了解決軟骨細胞體外大規模培養問題，近年來開始應用微載體培養軟骨細胞或其他細胞。微載體可由Ⅱ型膠原蛋白、葡聚糖Cytodex 3構成，懸浮在培養液中的微球為細胞提供了廣闊的黏附面積，使細胞有大量空間進行增殖。

(二)骨髓間充質干細胞

MSC有多向分化潛能，也可以作為軟骨組織工程種子細胞。從成人一次骨髓穿刺中獲取的骨髓間充質干細胞可在體外連續培養30代以上，數量擴增100萬倍以上，仍保持向軟骨細胞分化的能力。用不同生物活化因子誘導MSC，結合相應的生物材料，可構建出工程化骨軟骨復合體，因此，MSC是一種比較理想的種子細胞。

(三)胚胎干細胞

胚胎內細胞團和桑葚胚中部分細胞具有分化成各種組織器官的潛能，這部分細胞被稱為胚胎干細胞。在BMP-2和BMP-4的作用下，ESC可分化為軟骨細胞。ESC作為種子細胞除具有增殖能力外，還具有再生潛能，可維持整個生命過程中細胞的更新和正常的功能，但使用ESC作為軟骨組織工程種子細胞，體外培養及誘導條件要求嚴格，還存在自發分化、致瘤性和倫理學問題。

生長因子

BMP和TGF-β可誘導間充質細胞分化成軟骨組織。TGF-β1即軟骨誘導因子A，是軟骨組織工程的首選生長因子，具有多重生物效應:①促進軟骨基質合成。適當劑量的TGF-β1能促進關節軟骨細胞增殖和合成軟骨特異性Ⅱ型膠原及蛋白多糖，還能使多糖硫酸程度更高，更加復合軟骨的生理特點。TGF-β1能誘導MSC向軟骨細胞和成骨細胞分化，從而可很好地再生關節軟骨和軟骨下骨板。關節內反復注射或者通過基質材料控釋TGF-β1，可促進關節軟骨缺損的修復。但是大劑量反復注射則可引起滑膜增生和骨贅形成。②抑制軟骨分解代謝。關節軟骨缺損修復遠期療效不佳的一個重要原因是，在創傷或骨關節炎等疾病引起的關節軟骨缺損的病理過程中，有許多炎性介質參與軟骨基質的降解，如白介素(IL-1、IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN-γ)、一氧化氮(NO)、基質金屬蛋白酶(MMPs)等，而TGF-β1能抑制所有這些炎性介質的活性，并能促進MMPs抑制劑(TIMP)表達，從而抑制軟骨分解代謝，提高修復質量。③TGF-β1還是一種強烈的免疫抑制劑，其作用比環孢素強很多倍，從而使同種異體移植更為安全。

FGF-2(bFGF)對軟骨細胞既是有絲分裂原又是形態發生因子，軟骨組織中含有大量生物活性bFGF。培養的軟骨細胞生長活躍時，只有在適當濃度的bFGF作用下才能保持其分化活性，合成軟骨特異性細胞外基質，抑制其終末分化和鈣化，否則很快去分化，轉化為成纖維細胞外觀，bFGF甚至能將一些已經成熟或者轉化為成纖維細胞的細胞反分化為軟骨細胞。對靜止軟骨細胞或者發生去分化已生長至融合的細胞，bFGF不能再恢復其軟骨表型。關節內注射bFGF能使正常情況下不能修復的軟骨缺損完全修復。

組織工程化軟骨的構建及應用

組織工程化軟骨的構建也包括兩種方法:一是將支架材料與軟骨細胞復合直接植入到軟骨缺損區;另一種是將特定形狀的可降解支架材料與軟骨細胞復合后植入到裸鼠或者體內皮下，經數周后形成特定形狀的軟骨，再移植到體內所需部位。如用此種方法構建成耳廓軟骨或氣管軟骨，用于修復耳廓或者氣管的缺損。目前如何制備組織工程化軟骨用于臨床是研究的主要目標之一。傳統的培養方法很難制備出高質量的工程化軟骨以滿足臨床需求。和傳統的方法相比，生物反應器培養系統具有以下優點:①通過有效的混合方式使種子細胞在三維支架材料中均勻分布;②動態流體環境能使營養物質充分擴散至整個細胞/支架三維復合物中，使所有細胞都能均勻獲得充分的營養;③可充分模擬體內生理環境，通過各種生化和流體力學刺激信號對細胞生長進行有效的調控。目前人們已經研制出多種模擬體內環境的培養系統:如模擬微重力旋轉生物反應器、固體旋轉生物反應器、攪動混合旋轉培養瓶系統、連續灌注培養系統、環繞混合培養形態等。軟骨細胞/材料復合物在靜止培養皿中培養時，僅下層可形成軟骨基質，在環繞混合培養皿中培養時，方可形成均勻的細胞外基質，而在旋轉生物反應器中可培養出厚度達5mm以上的人工軟骨，各種生化和力學指標均顯著高于前兩種方法，但是和正常軟骨組織相比仍存在一定的差異。在旋轉生物反應器中培養6周時，總膠原含量占正常軟骨的39%，其中90%為Ⅱ型膠原，水滲透性為正常的4倍，而平衡模量僅占正常軟骨的18%;培養7個月時，總膠原含量占正常的38%，其中75%為Ⅱ型膠原，水滲透性和平衡模量與正常相當。說明這種培養系統雖能顯著提供新生軟骨質量，但還需進一步改進。

在骨、軟骨組織工程的研究中，如何能保持生長因子的有效的生物活性和對種子細胞的調控是一個亟待解決的難題，是用外源性生長因子調控種子細胞存在一些問題:需要復雜的純化過程，故價格較昂貴;生長因子半衰期短，局部使用時可以被稀釋，故需反復使用或加大劑量，從而增加了成本和副作用。基因治療給上述問題的根本解決帶來了可能。

基因治療是將外源性生長因子的基因導入目的細胞中并使它有效表達，達到治療的目的。在組織工程研究中，可將促進骨軟骨細胞生長的基因導入種子細胞，達到持續促進細胞分化增殖的目的。基因治療用于組織工程的優點是:①受體細胞可持續高效表達目的基因以調控期自身及其他效應細胞的生長以獲得人們所需的特定功能替代;②轉基因細胞合成分泌的內源性蛋白經過了適當的翻譯后修飾過程，具有更多的可識別的配體，能更有效地同細胞受體結合，因此其表達產物活性更高，所需產物量更小(ng或pg水平)，大大減少了外源性重組蛋白大劑量(mg或μg水平)反復使用的副作用;③質粒DNA和載體制備容易、穩定性好、半衰期長，價格遠遠低于純化的重組蛋白;④免疫排斥反應亦可借助此技術得到解決。可對胚胎干細胞進行基因操作或將有免疫抑制作用的基因轉入種子細胞內，也可改變抗原表面決定簇或者清除不需要的抗原呈遞細胞。例如TGF-β1是一種強烈的免疫抑制劑，其作用比環孢素還要強烈，同時它又可以調節骨、軟骨等多種細胞的增殖分化，將TGF-β1基因轉入相關細胞中，不僅能獲得所需的功能，而且能抑制可能的免疫排斥反應。

作者的研究小組將具有促進種子細胞增殖分化、抑制多種炎性介質活性及免疫排斥反應等多重生物學效應的TGF-β1基因轉入關節軟骨組織工程的種子細胞——間充質干細胞，并與具有良好生物相容性和結構相容性的涂附多聚賴氨酸的聚DL乳酸的可降解多孔支架材料復合移植，修復同種異體兔股骨髁全厚關節軟骨缺損。通過體內外實驗，以空載體轉染MSC為對照，檢測:①MSC能否作為基因治療的受體細胞并穩定表達生物活性的TGF-β1;②基因轉染的量效關系;③TGF-β1基因轉染對MSC增殖分化的影響;④TGF-β1基因轉染對炎性介質如白介素1(IL-1)的抑制作用;⑤基因治療的安全性;⑥TGF-β1基因轉染能否提高同種異體兔全厚關節軟骨缺損的修復質量和遠期療效。

結果顯示:①MSC能作為基因治療的受體細胞并能在體外穩定表達生物活性的TGF-β1至少4周以上。②當細胞接種密度、生長狀態及反應時間保持不變時，TGF-β1表達質粒與脂質體的劑量為2/3、2/6、及1/6(μg/μl)時，轉染效率即TGF-β1表達量最高。③TGF-β1基因轉染對MSC增殖分化的影響也與劑量有關。1μg/3μl劑量TGF-β1基因轉染能獲得最佳轉染效率和促進MSC增殖分化效應;流式細胞儀檢測顯示此劑量TGF-β1基因轉染能顯著提高S期的DNA含量，使停滯于G0/G1期的細胞進入S期，促進MSC增殖;透射電鏡觀察顯示此劑量實驗組的MSC功能更加活躍;轉基因細胞/支架材料復合培養掃描電鏡觀察進一步證實此劑量實驗組的MSC增殖分化活性明顯優于對照組。④TGF-β1基因轉染能顯著抑制IL-1對羥脯氨酸合成的降解作用。⑤軟瓊脂培養及透射電鏡觀察顯著轉基因的MSC并未向惡性方向轉化，初步證明了TGF-β1基因治療的安全性。⑥體內實驗透射電鏡及組織學結果顯示實驗組新生組織未透明樣軟骨，細胞外基質主要是軟骨特征性的Ⅱ型膠原纖維，關節面平整，軟骨下骨完全再生，與宿主骨結合緊密，未見免疫排斥反應;對照組則新生軟骨質量欠佳，細胞外基質為Ⅰ、Ⅱ型混雜膠原纖維，與宿主骨整合欠佳，有不同程度的免疫排斥反應。

實驗表明:利用TGF-β1生物學效應的多重性，通過轉基因技術使TGF-β1持續高效發揮作用，促進種子細胞增殖分化、抑制多種炎性介質活性及免疫排斥反應，使提高關節軟骨缺損的修復質量和遠期療效成為可能。

目前，組織工程化軟骨已開始應用于臨床修復關節軟骨輕度缺損，近期療效較好，遠期療效尚待進一步觀察。但仍存在如組織工程化軟骨過早退變、耐磨性較差及易纖維化等問題尚待解決。

參考文獻

1.Khademhosseini A，Vacanti JP，Langer R.Progress in tissue engineering.Sci Am，2009，300(5): 64-71

2.Bose S，Roy M，Bandyopadhyay A.Recent advances in bone tissue engineering scaffolds.Trends Biotechnol，2012，30(10): 546-554

3.Naito Y，Shinoka T，Duncan D，et al.Vascular tissue engineering: towards the next generation vascular grafts.Adv Drug Deliv Rev，2011，63(4-5): 312-323

4.Amini AR，Laurencin CT，Nukavarapu SP.Bone tissue engineering: recent advances and challenges.Crit Rev Biomed Eng，2012，40(5): 363-408

5.郝杰，鄭啟新.組織工程中生物材料表面修飾的研究.國際生物醫學工程雜志，2002，25(4): 180-184

6.Howard D，Buttery LD，Shakesheff KM，et al.Tissue engineering: strategies，stem cells and scaffolds.J Anat，2008，213(1): 66-72

7.Kon E，Filardo G，Roffi A，et al.Bone regeneration with mesenchymal stem cells.Clin Cases Miner Bone Metab，2012，9(1): 24-27

8.Li JF，Lin ZY，Zheng QX，et al.Repair of rabbit radial bone defects using true bone ceramics combined with BMP-2-related peptide and type I collagen.Mater Sci Eng C，2010，30: 1272-1279

9.Bose S，Tarafder S.Calcium phosphate ceramic systems in growth factor and drug delivery for bone tissue engineering: a review.Acta Biomater，2012，8(4): 1401-1421

10.King WJ，Krebsbach PH.Growth factor delivery: how surface interactions modulate release in vitro and in vivo.Adv Drug Deliv Rev，2012，64(12): 1239-1256

11.Lee JY，Choi YS，Lee SJ，et al.Bioactive peptide-modified biomaterials for bone regeneration.Curr Pharm Des，2011，25(17): 2663-2676

12.Lovett M，Lee K，Edwards A，et al.Vascularization strategies for tissue engineering.Tissue Eng Part B Rev，2009，15(3): 353-370

13.Novosel EC，Kleinhans C，Kluger PJ.Vascularization is the key challenge in tissue engineering.Adv Drug Deliv Rev，2011，63(4-5): 300-311

14.Amini AR，Laurencin CT，Nukavarapu SP.Differential analysis of peripheral blood-and bone marrow-derived endothelial progenitor cells for enhanced vascularization in bone tissue engineering.J Orthop Res，2012，30(9): 1507-1515

15.Ovsianikov A，Schlie S，Ngezahayo A，et al.Two-photon polymerization technique for microfabrication of CAD-designed 3D scaffolds from commercially available photosensitive materials.J Tissue Eng Regen Med，2007，6(1): 443-449

16.李景峰，鄭啟新.納米羥基磷灰石仿生骨材料的研究進展，國際生物醫學工程雜志，2011，34(4): 235-239

17.鄭啟新，汪健，郭曉東.急性脊髓損傷后神經保護的研究現狀與展望.中華實驗外科雜志，2012，29(7): 1213-1216

18.賈杰，楊述華，張宇坤，等.不同細胞接種密度體外構建“自組裝”工程化軟骨的實驗研究.中國矯形外科雜志，2012，20(11): 1030-1033