第3章　蛋白質化學

3.1　復習筆記

一、蛋白質的重要性和一般組成

1蛋白質的重要性

（1）蛋白質是生物機體的結構物質；

（2）蛋白質是生物的功能物質；

（3）蛋白質與生命起源相關。

2蛋白質的一般組成

氨基酸是蛋白質的基本結構單位。所有蛋白質都含有C、H、O、N這4種元素，部分還含有S、P、Fe等元素。

3蛋白質含量的分析

凱氏定氮法：各種蛋白質的含氮量接近于16%，分析一個樣品的蛋白質含量時，一般都先測樣品的總氮量百分數，再乘以常數6.25。6.25即100/16，為1g氮所代表的蛋白質重量。

二、氨基酸

1氨基酸的結構和特性

（1）氨基酸的結構通式

氨基酸是既含氨基又含羧基的有機化合物。常見的氨基酸有20種，且都是α-氨基酸（脯氨酸除外）。α-氨基酸是指羧酸分子中α-碳原子上的一個氫原子被氨基取代而成的化合物，其通式為：

圖3-1　α-氨基酸的結構通式

（2）氨基酸的構型

所有的氨基酸中除甘氨酸（Gly）無D-及L-型之分外，一切α-氨基酸的α-碳原子皆為不對稱，都有D-及L-兩種異構體，天然的氨基酸中沒有D構型的氨基酸。具有特殊構型的氨基酸有：

①甘氨酸：分子結構對稱，無手性。

②賴氨酸：有兩個氨基，一個在α位，另一個在ε位。

③脯氨酸：氨基為亞氨基。

2氨基酸的分類及其結構

氨基酸有200多種，包括常見的蛋白質氨基酸、不常見的氨基酸和非蛋白質氨基酸。

（1）常見的蛋白質氨基酸

常見的蛋白質氨基酸的分類、名稱和符號如表3-1所示。

表3-1　天然氨基酸的分類、名稱和符號

常見的20種蛋白質氨基酸，其差別在于側鏈R基團，可根據R基團的結構或極性進行分類，具體分類如表3-2所示。

表3-2　常見20種氨基酸的分類

（2）不常見的蛋白質氨基酸

不常見的氨基酸是在肽鏈合成后，經專一酶催化，對常見氨基酸進行修飾而形成。包括：4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、甲基組氨酸、甲基賴氨酸、γ-羧基谷氨酸、甲狀腺素、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸。

注：硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸是在蛋白質合成時摻入，而不是合成后經修飾產生的。

（3）非蛋白質氨基酸

非蛋白質氨基酸不存在于蛋白質中，而是以游離或結合的形式存在于生物體內，它們大多是常見氨基酸的衍生物，如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、鳥苷酸、瓜氨酸、高絲氨酸等。

3氨基酸的溶解度、旋光性和光吸收

（1）氨基酸的溶解度

在水中，胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等的溶解度很小；精氨酸、賴氨酸易溶于水；在鹽酸溶液中一切氨基酸都可有不同程度的溶解度。

（2）氨基酸的旋光性

①旋光度

組成蛋白質的氨基酸（甘氨酸除外），都有不對稱C原子，因此都具有旋光性。能使偏振光的偏振面向左或向右旋轉，向左旋轉的稱左旋，用“－”號表示，向右旋轉的稱右旋，用“＋”號表示。使偏振面旋轉的角度為旋光度。

②比旋光度

氨基酸的比旋光度是指1g/ml的氨基酸溶液，在1dm長度的旋光管內，20℃，鈉光D線下的旋光度。它是α-氨基酸的物理常數之一，也是鑒別各種氨基酸的一種根據。比旋光度與氨基酸R側鏈基團的性質和溶液的pH有關。

③外消旋作用

當用堿水解蛋白質時，會使氨基酸產生外消旋作用，引起D-型和L-型氨基酸的互變，產生等量的D-型和L-型兩種異構體，這時旋光互相抵消，得到的是無旋光性的DL-消旋物。

（3）氨基酸的光吸收

Trp、Tyr和Phe中有共軛雙鍵，因此它們在紫外區有吸收能力。其中Trp的最大吸收波長為280nm；Tyr的最大吸收波長為275nm；Phe的最大吸收波長為257nm。蛋白質中由于含有Trp、Tyr和Phe，所以也有紫外吸收能力，一般最大光吸收在280nm波長處。

4氨基酸的酸堿性質

（1）氨基酸的兩性離子形式

氨基酸在中性水溶液中羧基會放出質子，氨基接受質子，這樣就使一個中性形式的氨基酸分子變成了帶正、負電荷相等的兩性離子。

（2）氨基酸的兩性解離和等電點的計算

①氨基酸的兩性解離

所有氨基酸都含有堿性的α-氨基和酸性的α-羧基，因此既可發生酸性解離也可發生堿性解離，為兩性電解質。

②氨基酸的等電點

氨基酸等電點的定義及特點和計算方法如表3-3所示。

表3-3　氨基酸等電點的定義及特點和計算方法

5氨基酸參與的重要化學反應

氨基酸的重要性質與它的結構基團相關，他們分別能發生如表3-4中的特殊反應。

表3-4　氨基酸基團參與的反應

6氨基酸分析

氨基酸分析是指將樣品中所含的各種氨基酸分開，并對每種氨基酸進行定性、定量測定。

（1）分配層析

原理：分配層析由固定相和流動相組成，混合物在層析系統中的分離取決于該混合物的各組分在這兩相溶劑中的分配情況，一般用分配系數K_d來表示。K_d差異愈大，愈容易分離

分配系數K_d是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中分配時，在一定溫度和壓力下達到平衡后，溶質在兩相中的濃度比值。

①紙層析

紙層析是用濾紙作為支持物，利用極性和非極性氨基酸在水（固定相）和有機溶劑（流動相）中溶解度不同的特點，在濾紙上進行分離的一種方法。

②聚酰胺薄膜層析

聚酰胺薄膜層析是利用聚酰胺薄膜作為支持物的一種分配層析。常用來分析氨基酸的衍生物，如DNS-氨基酸。

③薄層層析

薄層層析利用硅膠、纖維素或氧化鋁作為支持物在玻璃板上做成一個均勻薄層，將樣品加到薄層的一端，然后將載樣品的玻板浸入盛有適當溶劑的密閉容器內放置使氨基酸各自分開。

（2）離子交換層析

離子交換層析利用離子交換劑上的活性基團和周圍溶液中的離子進行交換時各種離子交換能力和洗脫時各種順序的不同來達到分離的目的。交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂兩大類。各個氨基酸的洗脫順序：酸性氨基酸＞中性氨基酸＞堿性氨基酸。

（3）高效液相層析（HPLC）

在氨基酸分析中用得最多的高效液相層析是反相層析。反相層析是指流動相極性大于固定相極性的一種分配層析。在反相層析中，極性最大的組分首先流出。

HPLC的特點有：

①固體支持劑顆粒很細，表面積大，分離效果好；

②溶劑系統采取高壓，洗脫速度增大；

③使用高靈敏度的柱后檢測器，快速、靈敏、高效。

7氨基酸的制備和用途

（1）氨基酸的制備

①水解蛋白質法

酸、堿或蛋白酶水解蛋白質為氨基酸，經適當方法分離、提純即可得所需要的某些氨基酸。

②人工合成法

可根據需要進行制備，缺點是用有機合成方法制備出的氨基酸均為外消旋產物。

③微生物發酵法

利用天然或改造之后的微生物生成氨基酸，優點是多、快、好、省。例如利用谷氨酸棒狀桿菌發酵生成谷氨酸。

（2）氨基酸的用途

①科學實驗肽和蛋白質（肽）的人工合成和代謝的利用；

②醫藥衛生方面的使用；

③食品烹調方面的利用。

五、肽

1肽的結構和命名

（1）肽、肽鍵

蛋白質分子是由許多氨基酸通過肽鍵相連而成的生物大分子。其中肽鍵是一種酰胺鍵，是由一個氨基酸的α-氨基和另一個氨基酸的α-羧基脫水縮合形成的化學鍵。氨基酸之間通過肽鍵連接而成的鏈稱肽鏈，簡稱肽。

圖3-2　肽鍵組成示意圖

①氨基端（N端）：肽鏈中帶自由氨基的氨基酸一端。

②羧基端（C端）：肽鏈中帶自由羧基的氨基酸一端。

③氨基酸殘基：肽鏈中的氨基酸分子因脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基。

④肽鏈的寫法：N端寫在左邊，而C端寫在右邊。

⑤寡肽和多肽：常將十個以下氨基酸殘基組成的肽鏈稱為寡肽，更長的肽鏈則稱為多肽。

（2）肽的命名

肽命名時，根據氨基酸組成，從N端開始依次命名。用三字符號或單字符號表示氨基酸殘基，用“-”或“·”表示肽鍵。

2肽的理化性質

（1）肽具有兩性解離性質，與氨基酸相同。

（2）肽具有旋光性。

肽具有旋光性，一般短肽的旋光度約等于組成該肽中各個氨基酸的旋光度的總和。

（3）肽的化學反應

肽的游離α-氨基、α-羧基及R基可以發生與氨基酸中相應基團的類似反應。主要有：

①茚三酮反應

肽的N端氨基酸殘基和茚三酮也能發生定量反應，生成藍紫色，反應過程中并不放出CO₂。

②雙縮脲反應

當分子中有兩個或兩個以上酰胺基時，與堿性CuSO₄反應，生成紫紅色復合物，即雙縮脲反應，此反應是肽和蛋白質所特有的顏色反應。反應顏色的深淺與肽或蛋白質的含量成正比，但是靈敏度較差。

3天然存在的活性肽

（1）肌肽和鵝肌肽（二肽）

①具有抗氧化作用，保護細胞膜免受損傷；②具有抗衰老和促進傷口愈合等作用。

（2）谷胱甘肽（GSH）

由Glu、Cys和Gly組成的一個重要三肽，根據其性質可分為氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽。谷胱甘肽可參與細胞內的氧化還原反應保護細胞，是一些酶的輔酶組成成分。

（3）腦啡肽

在高等動物腦中發現的具有鎮痛作用的活性肽。

（4）催產素和升壓素

在下丘腦的神經細胞中合成的多肽激素，它們都是九肽，分子中含有環狀結構。

（5）多肽抗生素

多肽抗生素也稱多肽抗菌素，它們往往成環狀，而且含有D-型氨基酸。

（6）α-鵝膏蕈堿

α-鵝膏蕈堿能抑制真核生物RNA聚合酶Ⅱ的活性，從而抑制mRNA的合成，但不影響原核生物RNA的合成。

4肽的人工合成

肽的人工合成方法有液相合成法（在液體溶液中進行）和固相合成法（在固體支持物上進行）。

六、蛋白質的分類

蛋白質的詳細分類如表3-5所示。

表3-5　蛋白質的詳細分類

七、蛋白質的結構

1蛋白質結構的分類

蛋白質的結構可分為一級結構、二級結構、三級結構、四級結構。它們的定義及維持結構的作用力如表3-6所示。

表3-6　蛋白質的結構

2蛋白質分子中的重要化學鍵

表3-7　蛋白質的重要化學鍵

3蛋白質結構的研究方法

（1）一級結構的研究方法

利用雙縮脲試劑反應和Sanger的末端分析法進行分析，人工合成肽檢驗。

（2）高級結構的研究方法

蛋白質三維結構最常用的方法是X射線衍射法和核磁共振光譜法（NMR）。其他方法還有：①重氫交換法：測α螺旋。②圓二色性（CD）：測α-螺旋及β-折疊含量。③熒光偏振法：測親水和疏水區域的分布。④紅外偏振法：測定蛋白質的二級結構。

4蛋白質的一級結構研究

（1）蛋白質一級結構的測定

①序列測定前的準備工作

a．樣品均一，純度在97%以上。

b．測定蛋白質的相對分子質量，允許誤差在10%左右。

c．測定肽鏈的數目。

d．測定氨基酸組成。

②序列測定的原理

一級結構的測定多半用小片段重疊的原理，即用兩種或兩種以上不同的方法將蛋白質多肽鏈水解，各自得到一系列肽段，然后將這些肽段分離純化，分別測定這些肽段的氨基酸序列，最后比較這些肽段之間的重疊關系，從而推出整個蛋白質分子中氨基酸的序列。

③測定的步驟

蛋白質一級結構的測定順序為末端（N端、C端）分析→肽鏈的拆分→肽鏈部分水解、分離純化→肽段的氨基酸序列測定→找“重疊肽”，推斷整個肽鏈的氨基酸序列→二硫鍵位置的確定。

表3-8　蛋白質一級結構分析的方法

（2）胰島素的一級結構

胰島素由A、B兩條鏈組成，A鏈21個氨基酸殘基，B鏈30個氨基酸殘基，有3對二硫鍵，其中兩對在A鏈和B鏈之間，另一對在A鏈內部。

5蛋白質的二級結構

表3-9　蛋白質二級結構及其特點

表3-10　α-螺旋與β-折疊對比

6蛋白質的超二級結構和結構域

（1）蛋白質的超二級結構

蛋白質的超二級結構是指二級結構的基本結構單位相互聚集，形成有規律的二級結構的聚集體。主要有三種形式：

①αα結構

αα是兩個α螺旋互相纏繞，靠疏水側鏈的疏水作用而互相結合，自由能很低，存在于纖維狀蛋白質中。

②βαβ結構

βαβ是由兩段平行的β折疊通過一段α螺旋連接而形成的結構。

③ββ結構

ββ結構是由兩段反平行的β折疊通過連接肽連接而成，其連接肽的長度通常為2～4個殘基，這種結構稱β發夾。

（2）蛋白質的結構域

結構域是指多肽鏈在二級結構或超二級結構的基礎上形成三級結構的局部折疊區，是相對獨立的緊密球狀實體。大體可分為4類：反平行α-螺旋結構域、平行或混合型β-折疊片結構域、反平行β-折疊片結構域和富含金屬或二硫鍵結構域。

7蛋白質的三級結構

蛋白質的三級結構是指多肽鏈在二級結構的基礎上進一步折疊、盤繞成復雜的空間結構。三級結構涉及蛋白質分子或亞基內所有原子的空間排布，但不涉及亞基之間的關系。主要靠非共價鍵來維持。蛋白質三級結構的形成和穩定主要靠次級鍵，如疏水作用、鹽鍵、氫鍵和范德華力等。

8蛋白質的四級結構

（1）蛋白質的四級結構

蛋白質的四級結構由具有三級結構的蛋白質分子亞基按一定方式聚合起來成蛋白質大分子。

（2）亞基

亞基又稱亞單位，是指蛋白質四級結構中以非共價鍵連接的肽鏈。在四級結構中，各亞基間的結合力主要是疏水鍵，其次為氫鍵和離子鍵。具有四級結構的蛋白質又稱為寡聚蛋白質。

9纖維狀蛋白質和球狀蛋白質的結構

（1）纖維狀蛋白質的結構

纖維狀蛋白質包括角蛋白、絲心蛋白和膠原蛋白3類。它們的結構由氫鍵維持。

①角蛋白

α-角蛋白主要由右手α螺旋多肽組成，含胱氨酸特別多。

②絲心蛋白

絲心蛋白是天然存在的β-角蛋白，是由伸展肽鏈沿纖維軸平行排成反平行β折疊結構。鏈間主要以氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。

③膠原蛋白

存在于皮膚、軟骨和骨質內，由不溶的線性原纖維組成的纖維束平行排列而成。

（2）球狀蛋白質的結構

典型球蛋白質主要有肌紅蛋白和血紅蛋白兩類。肌紅蛋白為骨骼肌的輸氧蛋白，血紅蛋白是脊椎動物紅細胞內的呼吸蛋白。血紅蛋白由4個多肽亞基組成，每個亞基都有一個血紅素基和一個氧結合部位。

八、蛋白質的重要性質

1膠體性質

蛋白質的分子都很大，在水中形成膠體溶液，故具有膠體溶液的性質：丁達爾效應、布朗運動以及不能透過半透膜。維持蛋白質穩定的因素是膠體顆粒表面所帶的電荷和水化膜。

2酸堿性質和等電點

（1）酸堿性質

蛋白質是兩性電解質，當溶液pH較其等電點pH偏酸時為正離子，較等電點pH偏堿時為負離子。

（2）等電點

①蛋白質的等電點是指蛋白質所帶的正電荷數與負電荷數相等時溶液的pH。

②測定蛋白質等電點必須在有一定離子強度的適當緩沖液中進行。

③在水溶液中蛋白質的等電點一般是偏酸的，因為羧基解離度比氨基解離度大。

④等電點時，蛋白質較穩定。

3電泳現象

蛋白質是兩性解離物質，在偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負電荷，通電時，帶電荷的蛋白質粒子在電場中向帶相反電荷的電極移動，這種移動現象稱蛋白質電泳。蛋白質在等電點溶液中無電泳現象。

4變性與凝固現象

（1）變性作用與凝固作用

①變性作用是指天然蛋白質受物理或化學因素的影響，分子內部的高度規則性的空間排列發生變化，致使其原有性質和功能發生部分或全部喪失的現象。

②凝固作用是指天然蛋白質變性后，所得的變性蛋白質分子互相凝聚或互相穿插纏結在一起的現象，是蛋白質變性后進一步發展的不可逆的結果。

（2）變性蛋白質的特性

溶解度降低、黏度增加、結晶能力消失、生物學活性喪失、易被蛋白酶水解、反應基團數目增加等。

（3）引起變性的因素

①物理因素：高溫、高壓、紫外線、電離輻射及超聲波等。

②化學因素：強酸強堿、有機溶劑、重金屬鹽、去污劑等。

5別構作用

別構作用是指含亞基的蛋白質由于一個亞基的構象改變而引起其余亞基和整個分子構象、性質和功能發生改變的作用，因別構而產生的效應稱別構效應。

6沉淀作用

蛋白質可因加酸、醇、中性鹽、重金屬鹽類或生物堿試劑而沉淀。

（1）加酸沉淀蛋白質

加酸使蛋白質溶液的酸堿度達到等電點，溶解度減低而沉淀，濃酸可使蛋白質成為不溶性變性蛋白質而沉淀。加酸并同時加熱，則更易沉淀。

（2）加中性鹽沉淀蛋白質（鹽析）

向蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽使其沉淀析出的現象稱為鹽析，常用（NH₄）₂SO₄、作為蛋白質鹽析劑。

（3）加有機溶劑沉淀蛋白質

乙醇、丙酮能吸水，破壞蛋白質膠粒上的水化層，而使蛋白質沉淀。低溫時，用丙酮脫水，還可保存原有的生物活性，但用乙醇脫水，時間較長后可使蛋白質變性而沉淀。

（4）加重金屬鹽沉淀蛋白質

蛋白質在堿性溶液中帶負電荷，可與重金屬離子如Zn^2＋、Cu^2＋、Hg^2＋、Pb^2＋、Fe^3＋等作用，產生重金屬蛋白鹽沉淀。鉛中毒或汞中毒時，可服蛋白質使與該重金屬結合嘔出，有解毒作用。

（5）加生物堿試劑沉淀蛋白質

生物堿試劑如單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸和三氯醋酸都能沉淀蛋白質。其沉淀原理是一般生物堿試劑皆為酸性物質，而蛋白質在酸性溶液中帶正電荷，故能與帶負電荷的酸根相結合，成為溶解度很小的鹽類而析出沉淀。

（6）抗體對抗原蛋白質的沉淀

抗體蛋白質遇異體的特異性抗原蛋白質即起沉淀或凝聚，使外來蛋白質失其生物作用。

7蛋白質的水解

酸、堿及蛋白質水解酶皆可破壞蛋白質的肽鍵，使蛋白質經過一系列的中間產物，最后產生氨基酸，這些中間產物中主要是蛋白胨。酸水解蛋白質可破壞色氨酸，堿水解可破壞半胱氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和精氨酸，因此酶水解方法比較可靠安全。

8蛋白質的顏色反應

表3-11　蛋白質重要顏色反應

九、蛋白質的結構與功能

1蛋白質一級結構與生物學功能的關系

一級結構是空間構象和蛋白質生物學功能的基礎；一級結構相似的蛋白質具有相似的高級結構與功能；氨基酸序列提供重要的生物進化信息（如細胞色素c的種屬差異與生物進化）；重要蛋白質的氨基酸序列改變可引起疾病（如血紅蛋白質異常病變導致鐮刀型貧血病）。

2蛋白質的三維結構與生物功能的關系

蛋白質的三維結構決定功能；蛋白質三維結構的改變可引發疾病。以肌紅蛋白和血紅蛋白為例說明蛋白質的三維結構與生物功能的關系。

（1）肌紅蛋白的結構與功能

肌紅蛋白是由一條肽鏈和一個血紅素輔基組成的結合蛋白。肌紅蛋白的主要生理功能是貯存和分配O₂。肌紅蛋白分子中的2個組氨酸殘基位于血紅蛋白的結合部位，具有關鍵性生物功能。由于肌紅蛋白中的血紅素處在一個疏水環境中，血紅素中的二價鐵則不易被氧化。當結合O₂時發生暫時性電子重排，O₂被釋放后鐵仍處于亞鐵狀態，能與另一個O₂結合，保證了肌紅蛋白中血紅素的氧合功能。

（2）血紅蛋白的結構與功能

①血紅蛋白（Hb）是一個由4個亞基（兩個α亞基和兩個β亞基）組成的四聚體。一分子Hb可結合4分子氧。

②血紅蛋白存在兩種主要構象態：T態（去氧血紅蛋白的主要構象）和R態（氧合血紅蛋白的主要構象）。氧結合引起血紅蛋白構象發生變化。

③紅蛋白的主要生理功能是運送氧。當氧與血紅蛋白分子中1個亞基血紅素的鐵結合后，血紅蛋白發生別構效應使它所在亞基的鹽鍵破裂，從而使原來結合變得松散，易與氧結合；鹽鍵的斷裂使β-亞基與氧結合的速度加快。氧合反應最后使鹽鍵全部斷裂，整個血紅蛋白的分子就成為氧合血紅蛋白的構象，大大提高了氧的結合。

（3）肌紅蛋白和血紅蛋白的氧合曲線如圖3-3所示。

圖3-3　肌紅蛋白和血紅蛋白的氧合曲線

注：血紅蛋白含4個亞基，具有別構作用，一個O₂的結合增加同一血紅蛋白分子中其余亞基與O₂的親和力，它的氧合曲線呈S形。而肌紅蛋白只有一條多肽鏈，沒有別構作用，它的氧合曲線是雙曲線。

十、其他蛋白

1糖蛋白

糖蛋白是一類糖與蛋白質以共價鍵連接而成的結合蛋白質。糖蛋白的非糖部分有多肽和小肽。

（1）糖蛋白的結構

分為N-連接糖蛋白和O-連接糖蛋白

①聚糖中的N-乙酰葡糖胺與多肽鏈中天冬酰胺殘基的酰胺氮以共價鍵連接，形成N-連接糖蛋白。

②O-連接型聚糖是指與蛋白質分子中絲氨酸或蘇氨酸羥基相連的糖鏈。

（2）糖蛋白的提取

多數糖蛋白都相當穩定，溶于水，從細胞或其他樣品抽提，可先將樣品磨成勻漿，加水和有機溶劑將脂質去掉，糖蛋白即存在于水溶液中。也可用其他試劑，如吡啶、二碘水楊酸鋰或螯合劑直接抽提。調節溶液的離子強度亦可使糖蛋白從溶液中分離出來。

（3）糖蛋白的生物學功能

①參與分子識別和細胞識別。

②參與蛋白質肽鏈的折疊和穩定。

③參與蛋白質的定向轉運。糖蛋白中的寡糖鏈提供了一個有關新合成蛋白質靶向的關鍵信息，在蛋白質定向轉運中起重要作用。

④參與機體免疫。參與機體免疫反應的免疫球蛋白都是糖蛋白。

⑤血型區分。人類的ABO血型是由A、B、H血型物質決定的，A、B、H血型物質的抗原決定簇是寡糖鏈。

2脂蛋白

脂蛋白是脂質與蛋白質以次級鍵結合而成的絡合物。脂蛋白的蛋白質部分稱脫輔基蛋白，又稱載脂蛋白。脫輔基蛋白與脂質之間的結合力主要靠次級鍵。脂蛋白可以分為細胞脂蛋白和血液脂蛋白兩類。

（1）細胞脂蛋白

細胞脂蛋白主要存在于生物膜、線粒體和微粒體中。細胞脂蛋白的脫輔基蛋白主要的是糖蛋白，脂質主要的是磷脂。

（2）血漿脂蛋白（表3-12）

血漿脂蛋白，又稱可溶性脂蛋白，在水中部分溶解。根據密度大小，血漿脂蛋白可分為乳糜微粒、極低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）4類。

表3-12　血漿脂蛋白

（3）脂蛋白的生物學作用

脂蛋白主要轉運脂質及固醇類物質。在細胞膜內，脂蛋白也是膜的結構物質。

3免疫球蛋白

免疫球蛋白又稱抗體，是指某些參與免疫反應的血清γ-球蛋白，分為5類，即：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。

（1）IgG是人血中含量最高的抗體，可形成多聚體。IgG主要由脾及淋巴結細胞合成，是唯一能通過胎盤的抗體，新生嬰兒臍帶血中都含有大量IgG。

（2）IgA主要存在于外泌液如鼻黏液、唾液、眼淚、氣管和腸胃黏膜分泌液中，有局部防疫功用，是初乳和乳中的主要抗體。

（3）IgD在人血清中含量很少。功能尚不清楚。

（4）IgE以五聚體形式存在，與抗過敏機制有關，人血清中含量很少。

（5）IgM是人體發育中首先合成的。當IgG的合成出現后，IgM的產生即被抑制，對細菌菌體有凝結作用。

4病毒蛋白

病毒蛋白是指構成病毒外殼的蛋白質，屬于結構蛋白質一類。病毒顆粒是由蛋白質包圍1個核酸所組成，無代謝功能，其核酸有致病作用。

十一、蛋白質的分離、純化和鑒定

制備蛋白質的方法可概括為細胞破碎、抽提、分離、純化和鑒定5步。

1細胞破碎

細胞破碎的方法有：

（1）動物細胞：電動搗碎機、勻漿器和超聲波破碎法。

（2）植物組織細胞：勻漿器和采用石英砂與抽提液混合磨研的方法。

（3）微生物細胞：溶菌酶處理除去細胞壁后再加超聲波處理進行破碎的方法。

（4）工業生產：微小石英砂混合研磨法、減壓法。

2抽提

（1）抽提原理

抽提/粗提是指將細胞破碎后的材料置于一定的條件及溶劑中，使被提取物釋放出來并進入溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態和生物活性的過程。抽提所用的緩沖液的pH值、離子強度、組成成分等條件的選擇，應根據被制備的蛋白質的性質而定。

（2）抽提方法

①水溶液抽提

蛋白質和酶的提取一般以水溶液為主。

a．稀鹽溶液和緩沖液有利于蛋白質的穩定。通常用0.02～0.05mol/L緩沖液和0.09～0.05mol/L NaCl溶液。

b．蛋白質和酶的溶解度及穩定性受pH影響。pH一般根據酶的穩定范圍進行控制。

c．為防止蛋白質的變性，一般在0～5℃的低溫進行提取，并加入蛋白抑制劑。

d．為加快被提取物的溶解，常采用溫和攪拌的方法，不宜產生氣泡，防止與氧氣接觸而氧化變性失活。

e．在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸有助于防止酶的巰基被氧化。

②有機溶液提取

a．一些蛋白質和脂類結合緊密而且含有較多非極性側鏈，難溶于水、稀鹽、稀酸和稀堿，需要用有機溶劑提取，如乙醇、丙酮、異丙醇等。

b．一些蛋白質既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機溶劑中，用稀的有機溶劑提取，可防止水解酶的破壞，并兼有除去雜質和提高純化效果的作用。

3分離

從組織中取得蛋白質抽提液，經離心或過濾將細胞碎片和部分雜質除去后，即可根據擬提蛋白質的特性和純度要求，用適當方法使蛋白質從抽提液中分離出來。常用的分離方法有鹽析法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、吸附法和超濾法等。

表3-13　蛋白質分離常用方法及原理

4純化

經分離的蛋白質仍含有各種雜質，還需進一步純化，以獲得更加純凈的蛋白質樣品。純化蛋白質常用的方法主要有如下幾種：

（1）離子交換層析

離子交換層析是利用不同蛋白質所帶電荷不同，因而與離子交換纖維素的可交換基團的交換能力不同，造成與離子交換纖維素結合的牢固程度就不同，當用適當的洗脫液洗脫時，各種蛋白質就以不同順序被洗脫下來，從而達到純化的目的。

（2）凝膠過濾

凝膠過濾又稱凝膠過濾層析、分子排阻層析或分子篩層析，是根據蛋白質分子大小不同來分離純化蛋白質的一種方法。凝膠過濾所用的介質是凝膠顆粒具有一定孔徑的網狀結構。當分子大小不同的蛋白質流經凝膠層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠顆粒而較快到達層析柱的底部并先從層析柱中流出。比網孔小的分子可以進入凝膠顆粒的網孔內，在凝膠顆粒內擴散，后從層析柱中流出，這樣就可將分子大小不同的蛋白質分開。

（3）疏水作用層析（HIC）

疏水作用層析又稱疏水層析，它是利用蛋白質表面的非極性基團和介質上的非極性基團間的疏水作用來分離蛋白質的層析方法。疏水作用層析的介質一般以瓊脂糖為母體，偶聯上非極性基團。由于不同蛋白質分子的疏水區強弱有較大差異，造成與介質上的疏水基團間相互作用的強弱不同，改變層析條件，使不同的蛋白質洗脫下來，高離子強度會增加疏水作用。

（4）親和層析

親和層析是根據蛋白質能與特異的配體相結合而設計的方法，將待純化蛋白質的特異配體通過連接臂連到不溶性的載體上后以適當的緩沖液裝入層析柱中。當蛋白質混合物流經此柱時，待純化的蛋白質可特異地結合到相應的配體上，其他的蛋白質則不被結合，最后通過洗滌除去未結合的雜蛋白。

（5）高效液相層析（HPLC）

HPLC由于支持物顆粒直徑小而均勻，機械性能好、化學性能穩定，溶劑系統采用高壓，這樣大大提高了分離的速度、分離度及重復性，可將差別很小的蛋白質很好地分離。

（6）快速蛋白質液相層析（FPLC）

FPLC適用于蛋白質、肽及多核苷酸的分離方法。在層析過程中，上樣、洗脫、收集、監控全部自動化。

（7）電泳法

根據不同蛋白質分子所帶凈電荷的不同，在電場中移動的速率各異，因而可以彼此分開。常用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。電泳法不適于大量蛋白質的分離純化。

（8）結晶

當蛋白質已經達到一定純度后，可用結晶方法將蛋白質純化。

5鑒定

將蛋白質分離、純化后，最后要對該蛋白質進行鑒定，主要包括純度鑒定、相對分子質量、等電點及生物活性的測定。

（1）純度鑒定

純度有一定的相對性，需要用兩種以上的方法相互驗證，才能確定一種蛋白質的純度。

（2）相對分子質量的測定

測定的方法有：超離心法、凝膠過濾法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法。

（3）等電點的測定

常用等電聚焦（IEF）的方法，等電聚焦是利用兩性電解質在電場中形成一個穩定的連續的pH梯度，電泳時蛋白質樣品將移向并聚焦在其等電點的pH梯度處，并形成一個很窄的區帶，區帶所處的pH即為該蛋白質的等電點。

6蛋白質含量的測定

測定蛋白質總量常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍染色法等。