掌握RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)。

【實(shí)驗(yàn)原理】

在進(jìn)行植物課題的研究過程中，無時(shí)無刻不用到RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)。

逆轉(zhuǎn)錄是提取出所需目的基因的mRNA，并以之為模板人工合成DNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA（主要是色氨酸t(yī)RNA）為引物，按5′→3′方向，合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫作互補(bǔ)DNA（complementary DNA, cDNA），它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過程。

mRNA分子易被RNase降解，而RNase極為穩(wěn)定且廣泛存在，因此在提取過程中嚴(yán)格防止RNase的污染，并設(shè)法抑制其活性，是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2h以上。凡是不能用高溫烘烤的材料（如塑料容器等）皆需用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理，DEPC和RNase的活性基團(tuán)——組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)，抑制RNase的活性。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理，方法為：加入DEPC至濃度為0.1%（體積分?jǐn)?shù)），過夜渦旋振蕩使之完全混勻，再用高壓蒸汽滅菌以消除殘存的DEPC。DEPC能與胺和巰基反應(yīng)，因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理，Tris溶液可用DEPC處理的水配制，然后高壓蒸汽滅菌。配制的溶液如不能高壓蒸汽滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。

【試劑與器材】

一、試劑

DEPC水：1000mLddH2O中加DEPC 1mL，配成終濃度為0.1%，用磁力攪拌器室溫?cái)嚢柽^夜，121℃高壓處理20min以滅活DEPC。

二、器材

勻漿器、手術(shù)器材（剪刀、鑷子）、恒溫箱、金屬浴、EP管、槍頭（三種規(guī)格）、鋁箔等。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

植物總RNA的提取根據(jù)情況采用了TRIZOL提取法和試劑盒兩種方法。

植物RNA提取試劑盒使用QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit。

一、TRIZOL提取法

1.液氮研磨花序組織至粉末狀，倒入1.5mLEP管中，加入TRIZOL 1mL。室溫放置5min，使核蛋白復(fù)合物充分裂解。

2.4℃，12000 r/min離心10min以去除不溶的組織，吸取上清液入新管；加入氯仿0.2mL，充分搖動(dòng)混勻，室溫放置2～3min。

3.4℃，12000 r/min離心15min，吸取上層水相入新管；加入0.5mL異丙醇，室溫放置10min以沉淀RNA。

4.4℃，12000 r/min離心10min，棄上清液；用預(yù)冷的75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃，7500 r/min離心5min。室溫開蓋放置以干燥沉淀。

5.加入適量無RNase的ddH2O溶解沉淀，即得到了總RNA。

6.消化RNA中混有的基因組DNA：取總量不超過5μg的RNA，加入DNaseⅠ（10 U/mL）1μL，37℃溫育30min。65℃放置10min以終止反應(yīng)并滅活DNase。最后得到的RNA于-80℃保存，或者直接進(jìn)行cDNA的合成。

7.cDNA第一鏈的合成使用Invitrogen公司的SuperScriptⅢReverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。操作方法如下：

（1）在無RNase的EP管中加入下列組分：

50μmol/L oligo（dT）：1μL；

10mmol/L dNTP：1μL；

植物總RNA：10 pg～5μg；

用無RNase的ddH2O補(bǔ)足體系至13μL。

65℃溫育5min，冰上放置至少1min。

（2）再繼續(xù)加入下列組分：

5×First-Strand buffer：4μL；

0.1mol/L DTT：1μL；

RNase抑制劑：1μL；

SuperScriptⅢRNase：1μL。

充分混勻后，50℃溫育1h，70℃滅活15min。得到的cDNA于-80℃保存或直接用于下一步實(shí)驗(yàn)。

二、使用OMEGA植物RNA提取試劑盒提取RNA

1.收集植物組織，液氮研磨，后置于冰上，加入RB緩沖液500μL（用之前1mLRB加入巰基乙醇20μL），渦旋混勻。14000g室溫離心5min。

2.吸取上清液放到gDNA filter Column中，14000g室溫離心2min，用1.5mL無RNase離心管收集流出液。

3.在流出液中加入0.5倍體積的無水乙醇，上下混勻5～10次。

4.將上述液體加入RNA Mini Column中，10000g離心1min，倒掉流出液。加入400μL RWC洗脫緩沖液（wash buffer），10000g離心1min。

5.換一個(gè)干凈的收集管，加入500μL RNA洗脫緩沖液Ⅱ，10000g離心1min（RNA洗脫緩沖液Ⅱ用之前加入一定量的無水乙醇）。重復(fù)一次。

6.倒掉流出液，放回收集管，10000g離心2min，完全消除無水乙醇。

7.換新的1.5mL離心管，加入DEPC水30μL，室溫放置2min，10000g離心1min，洗脫RNA。RNA保存-80℃，避免反復(fù)凍融。

8.使用TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（FSQ101）逆轉(zhuǎn)錄RNA，具體步驟如下：

（1）每管RNA中加入1μL無RNase的DNase，37℃孵育30min消化DNA，65℃15min使DNase失活。

（2）測RNA濃度。

（3）配制逆轉(zhuǎn)錄體系：

無核酸酶的水（Nuclease-free water）：nμL；

5×RT緩沖液（5×RT buffer）：2μL；

RT酶混合物（RT enzyme mix）：0.5μL；

引物混合物（primer mix）：0.5μL；

RNA：0.5 pg～1μg；

總體積10μL。

（4）37℃反應(yīng)15min，98℃5min終止反應(yīng)，將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA保存于-20℃。

【結(jié)果與分析】

rRNA條帶亮度一般表現(xiàn)為：28S＞18S＞5S，如果5S rRNA條帶過亮，則說明RNA發(fā)生降解。

【注意事項(xiàng)】

1.RNA制備的關(guān)鍵是要抑制細(xì)胞中的RNA分解和防止所用器具及試劑中的RNase的污染。因此，在實(shí)驗(yàn)中必須采取以下措施：戴一次性手套；使用RNA操作專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)；在操作過程中避免說話等。

2.盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前按下列方法進(jìn)行處理：用0.1%DEPC水溶液處理12h，然后在120℃下高溫滅菌30min以除去殘留的DEPC（RNA實(shí)驗(yàn)用的器具建議專門使用，不要用于其他實(shí)驗(yàn)。）。

3.DEPC屬于致癌物質(zhì)，易揮發(fā)，要小心在通風(fēng)櫥中操作，高壓蒸汽處理后會(huì)分解，其毒力消失。（用來泡器械的溶液不用高壓蒸汽處理，用來配制試劑的溶液要高壓蒸汽處理）。

【參考文獻(xiàn)】

陳銳.2012.水稻雄蕊早期發(fā)育過程的全基因組表達(dá)譜研究.北京：北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院.