第三節(jié) 固體菌種制作

一、母種生產(chǎn)

1.常用的斜面母種培養(yǎng)基配方

1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）配方：馬鈴薯（去皮）200克，葡萄糖20克，瓊脂18～20克，水1000毫升。

2）馬鈴薯葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基配方：馬鈴薯（去皮）200克，蛋白胨10克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升。

3）馬鈴薯綜合培養(yǎng)基配方：馬鈴薯（去皮）200克，磷酸二氫鉀3克，維生素B₁2～4片，葡萄糖20克，硫酸鎂1.5克，瓊脂20克，水1000毫升。

2.木腐菌種培養(yǎng)基

1）麥芽浸膏10克，酵母浸膏0.5克，硫酸鎂0.5克，硝酸鈣0.5克，蛋白胨1.5克，麥芽糖5克，磷酸二氫鉀0.25克，瓊脂20克，水1000毫升。

2）酵母浸膏15克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鈉2克，蔗糖10～40克，麥芽浸膏10克，氯化鉀0.5克，硫酸鎂0.05克，硫酸鐵0.01克，瓊脂15～25克，水1000毫升。

3.保藏菌種培養(yǎng)基

1）玉米粉50克，葡萄糖10克，酵母膏10克，瓊脂15克，水1000毫升。

2）蛋白胨10克，葡萄糖1克，酵母膏5克，瓊脂20克，水1000毫升。

3）硫酸鎂0.5克，磷酸氫二鉀1克，葡萄糖20克，磷酸二氫鉀0.5克，蛋白胨2克，瓊脂15克，水1000毫升。

4.母種培養(yǎng)基的配制

（1）材料準(zhǔn)備 選取無芽、無變色的馬鈴薯，洗凈去皮，稱取200克，切成1厘米左右的小塊。同時準(zhǔn)確稱取好其他材料。酵母粉用少量溫水溶化。

（2）熱浸提 將切好的馬鈴薯小塊放入1000毫升水中，煮沸后用文火保持30分鐘。

（3）過濾 煮沸30分鐘后用4層紗布過濾（圖2-34）。

（4）瓊脂溶化 將瓊脂粉事先溶于少量溫水中，然后倒入培養(yǎng)基浸出液中溶化。煮瓊脂時要多攪拌，直至完全溶化。

（5）定容 瓊脂完全溶化后，將各種材料全部加入液體中，加水定容至1000毫升，攪拌均勻。

（6）分裝 選用潔凈、完整、無損的玻璃試管，進(jìn)行分裝。一般分裝量為試管長度的1/5～1/4。

分裝完畢后，塞上棉塞（選用干凈的梳棉制作），棉塞長度為3～3.5厘米，塞入管內(nèi)1.5～2厘米，外露部分1.5厘米左右，松緊適度，以手提外露棉塞試管不脫落為度。然后將7支試管捆成1捆，用雙層牛皮紙將試管口一端包好扎緊（圖2-36）。

（7）滅菌 滅菌前，先向鍋內(nèi)加足水分，然后將包扎好的試管直立放入滅菌鍋套桶中，蓋上鍋蓋，對角擰緊螺釘（圖2-37），關(guān)閉放氣閥，開始加熱。嚴(yán)格按照滅菌鍋使用說明進(jìn)行操作，在0.15兆帕壓力下保持30分鐘。

（8）擺斜面 待壓力自然降壓至0時，打開放氣閥放掉余氣后，打開鍋蓋，自然降溫20～40分鐘后再擺放斜面。斜面長度以斜面頂端距離棉塞40～50毫米為好（圖2-38）。

（9）無菌檢查 隨機抽取3%～5%的試管，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，48小時后檢查，無任何微生物長出的為滅菌合格，即可使用。

5.母種接種

（1）接種前準(zhǔn)備

1）接種前，必須徹底清理打掃接種室（箱），經(jīng)噴霧和熏蒸消毒后，使其成為無菌狀態(tài)。工作人員穿好工作服，戴好口罩、工作帽。

2）清洗干凈接種工具，一般為金屬材料的針、刀、耙、鏟和鉤。

3）用肥皂水洗手，擦干后再用70%～75%酒精棉球擦拭雙手、菌種試管及一切接種用具。

4）可事先在試管上貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期等。

5）將接種所需物品移入超凈工作臺（接種箱），按工作順序放好，檢查是否齊全，并用5%石炭酸（苯酚）溶液重點在工作臺下方附近的地面上噴霧消毒，打開紫外線燈照射滅菌30分鐘（圖2-40）。

（2）接種

1）關(guān)閉紫外燈（若需開日光燈，需間隔20分鐘以上才可打開），用75%酒精對雙手（圖2-41）和母種外壁消毒，并點燃酒精燈，其火焰周圍10厘米區(qū)域均為無菌區(qū)，在該區(qū)接種可以避免雜菌污染。

2）將菌種和斜面培養(yǎng)基的2支試管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于兩試管之間的部分，斜面向上并使它處于水平位置，先將棉塞用右手?jǐn)Q轉(zhuǎn)松動，以利于接種時拔出。

3）右手拿接種鉤，在火焰上方將工具灼燒滅菌，凡在接種時進(jìn)入試管的部分，都用火焰灼燒滅菌，操作時要使試管口靠近酒精燈火焰。

4）用右手小拇指、無名指、中指同時拔掉2支試管的棉塞，并用手指夾緊，用火焰灼燒管口（圖2-42），灼燒時應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動試管口，殺滅試管口可能沾染上的雜菌。

5）將燒過并經(jīng)冷卻后的接種鉤伸入菌種管內(nèi)，去除上部老化、干癟的菌絲塊，然后取0.5厘米×0.5厘米大小的菌塊，迅速將接種鉤抽出試管，注意不要使接種鉤碰到管壁。

6）在火焰旁迅速將接種鉤伸進(jìn)待接種試管，將挑取的菌塊放在斜面培養(yǎng)基的中央（圖2-43）。注意不要把培養(yǎng)基劃破，也不要使菌種沾在管壁上。

7）抽出接種鉤，灼燒管口和棉塞，并在火焰旁將棉塞塞上。每接3～5支試管，要將接種鉤在火焰上再次灼燒滅菌，以防大面積污染。

6.培養(yǎng)

（1）恒溫培養(yǎng) 接種完畢，將接好的試管菌種放入22～24℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（2）污染檢查 接種后2天內(nèi)要檢查1次接種后雜菌污染的情況，如果在試管斜面培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)有綠色、黃色、黑色等非白色、非生長整齊一致的斑點、塊狀雜菌，應(yīng)立即剔除。以后每2天檢查1次。挑選出菌絲生長致密、潔白、健壯，無任何雜菌感染的試管菌種，放于2～4℃的冰箱中保藏。

二、原種、栽培種生產(chǎn)

1.常見培養(yǎng)基及制作

（1）以棉籽殼為主料培養(yǎng)基 見圖2-44。

1）棉籽殼培養(yǎng)基配方：

①棉籽殼99%，石膏1%，含水量60%±2%。

②棉籽殼84%～89%，麥麩10%～15%，石膏1%，含水量60%±2%。

③棉籽殼54%～69%，玉米芯20%～30%，麥麩10%～15%，石膏1%，含水量60%±2%。

④棉籽殼54%～69%，闊葉木屑20%～30%，麥麩10%～15%，石膏1%，含水量60%±2%。

2）棉籽殼培養(yǎng)基制作：先按配方比例計算出所需要的各原料的量，稱取原料，再加入適量的水。適宜含水量的簡便檢驗方法是用手抓一把加水拌勻后的培養(yǎng)料緊握，當(dāng)指縫間有水但不滴下時，料內(nèi)的含水量為適度。

（2）以木屑為主料培養(yǎng)基

1）木屑培養(yǎng)基配方：

①闊葉樹木屑78%，麩皮或米糠20%，蔗糖1%，石膏1%，含水量58%±2%。

②闊葉樹木屑63%，棉籽殼15%，麩皮20%，糖1%，石膏1%，含水量58%±2%。

③闊葉樹木屑63%，玉米芯粉15%，麩皮20%，糖1%，石膏1%，含水量58%±2%。

2）木屑培養(yǎng)基制作：同棉籽殼培養(yǎng)基的制作。

（3）以麥粒為主料培養(yǎng)基

1）麥粒培養(yǎng)基配方：小麥93%，雜木屑5%，石灰或石膏粉2%。

2）麥粒培養(yǎng)基制作：小麥過篩，除去雜物，再放入石灰水中浸泡，使其吸足水分，撈出后放入鍋中用水煮透。趁熱攤開，涼至麥粒表面無水膜，加入石膏、拌勻，然后裝瓶、滅菌。

（4）木塊木條培養(yǎng)基

1）木塊木條培養(yǎng)基配方：

①木條培養(yǎng)基：木條85%，木屑培養(yǎng)基15%。常用于塑料袋制栽培種，故通常稱為木簽菌種（圖2-46、圖2-47）。

②楔形和圓柱形木塊培養(yǎng)基：木塊84%，闊葉樹木屑13%，麩皮或米糠2.8%，白糖0.1%，石膏粉0.1%。

③枝條培養(yǎng)基：枝條80%，麩皮或米糠19.9%，石膏粉0.1%。

2）木塊木條培養(yǎng)基制作：

①木條培養(yǎng)基制作：先將木條在0.1%多菌靈液中浸0.5小時，撈起稍瀝水后即放入木屑培養(yǎng)基中翻拌，使其均勻地粘上一些木屑培養(yǎng)基即可裝瓶（袋）。裝瓶（袋）時尖頭要朝下，最后在上面鋪約1.5厘米厚的木屑培養(yǎng)基即可。

②楔形和圓柱形木塊培養(yǎng)基制作：先將木塊浸泡12小時，將木屑按常規(guī)木屑培養(yǎng)料的制作法調(diào)配好，然后將木塊倒入木屑培養(yǎng)基中拌勻、裝瓶（袋），最后再在木塊面上蓋一薄層木屑培養(yǎng)基按平即可。

③枝條培養(yǎng)基制作：選1～2年生、粗8～12毫米的板栗、麻櫟或梧桐等適生樹種的枝條，先劈成兩半，再剪成約35毫米長、一頭尖一頭平的小段，投入40～50℃的營養(yǎng)液中浸1小時，撈出瀝去多余水分，與麩皮或米糠混勻，再用濾出的營養(yǎng)液調(diào)節(jié)含水量后加入石膏粉拌勻，即可裝瓶、滅菌。其中營養(yǎng)液配方為：蔗糖1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.1%，混勻后溶于水即可。

2.培養(yǎng)基滅菌

（1）高壓滅菌 木屑培養(yǎng)基和草料培養(yǎng)基在0.12兆帕條件下滅菌1.5小時或0.14～0.15兆帕下1小時；谷粒培養(yǎng)基、糞草培養(yǎng)基和種木培養(yǎng)基在0.14～0.15兆帕條件下滅菌2.5小時。裝容量較大時，滅菌時間要適當(dāng)延長（圖2-48）。

（2）常壓滅菌 常壓滅菌是采用常壓滅菌鍋進(jìn)行蒸汽滅菌的方法（圖2-49）。鍋內(nèi)的水保持沸騰狀態(tài)時的蒸汽溫度一般可達(dá)100～108℃，滅菌時間以袋內(nèi)溫度達(dá)到100℃以上開始計時。常壓滅菌要在3小時之內(nèi)使滅菌室溫度達(dá)到100℃，并在100℃下保持10～12小時，然后停火燜鍋8～10小時后出鍋。母種培養(yǎng)基、原種培養(yǎng)基、谷粒培養(yǎng)基、糞草培養(yǎng)基和種木培養(yǎng)基，應(yīng)高壓滅菌，不應(yīng)常壓滅菌。常壓滅菌操作要點是“攻頭、控中、保尾”。“攻頭”是指菌袋裝鍋后3小時內(nèi)鍋內(nèi)溫度達(dá)到100℃；“控中”是指滅菌中途不能停火；“保尾”是指滅菌8～10小時后，停火燜5～6小時。

1）迅速裝料，及時進(jìn)灶：如果不能及時裝料和進(jìn)灶滅菌，料中存在的酵母菌、細(xì)菌、真菌等競爭性雜菌遇適宜條件迅速增殖，尤其是高溫季節(jié)，如果裝料時間過長，酵母菌、細(xì)菌等將基質(zhì)分解，容易引起培養(yǎng)料的酸敗，滅菌不徹底。

2）菌種袋應(yīng)分層放置：菌袋堆疊過高，不僅難以透氣，并且受熱后的塑料袋相互擠壓會粘連在一起，形成蒸汽無法穿透的“死角”。為了使鍋內(nèi)蒸汽充分流暢，菌種袋常采用順碼式堆放，每放4層，放置1層架隔開或直接放入周轉(zhuǎn)筐中滅菌。

3）旺火高溫3小時，加足水量，旺火升溫，高溫足時。在常壓滅菌過程中，如果鍋內(nèi)很長時間達(dá)不到100℃，培養(yǎng)基的溫度處于耐高溫微生物的適溫范圍內(nèi)，這些微生物就會在此時間內(nèi)迅速增殖，嚴(yán)重的造成培養(yǎng)料酸敗。因此，在常壓滅菌中，用旺火攻頭，使滅菌灶內(nèi)溫度在3小時內(nèi)達(dá)到100℃，是取得徹底滅菌效果的因素之一。

4）停火后操作：滅菌時間達(dá)到后，停止加熱，利用余熱再封閉8～10小時。待料溫降至50～60℃時，趁熱移入冷卻室內(nèi)冷卻；同時，趁熱進(jìn)行下一鍋菌袋的滅菌。

3.接種

（1）接種場所

1）接種車間：一般是在木耳工廠化生產(chǎn)菌包的接種室配備空氣凈化與消毒機，配合超凈工作臺進(jìn)行接種。

2）接種室：一般接種室面積以6米²為宜，長3米、寬2米、高2～3米。室內(nèi)墻壁及地面要平整、光滑，接種室門通常采用左右移動的推拉門，以減少空氣振動。接種室的窗戶要采用雙層玻璃，窗內(nèi)設(shè)黑色布簾，使得門窗關(guān)閉后能與外界空氣隔絕，便于消毒。有條件的可安裝空氣過濾器。

3）塑料袋接種帳：用木條或鐵絲做成框并用鐵絲固定，再將薄膜焊成蚊帳狀，然后罩在框架上，地面用木條壓住薄膜，即可代替接種室使用。接種帳的容量大小，可根據(jù)生產(chǎn)需要確定。一般每次可接種500～2000瓶（袋）。

4）接種箱：見圖2-50。

（2）消毒 把菌種瓶（袋）、滅菌后的培養(yǎng)基及接種工具放入接種場所，然后進(jìn)行消毒。先用3%的煤酚皂液或5%石炭酸水溶液噴霧消毒或使用氣霧消毒劑熏蒸消毒30分鐘，使空氣中微生物沉降，然后打開紫外線燈照射30分鐘后接種。操作者進(jìn)入接種室時，要穿工作服、鞋套，戴上帽子和口罩，操作前雙手要用75%酒精棉球擦洗消毒，動作要輕緩，盡量減少空氣流動。

（3）接種

1）原種接種：

①接種前準(zhǔn)備好清潔無菌的接種室、待接種的母種菌種、原種培養(yǎng)基及接種工具等，接種人員穿上工作服，將試管母種接入原種瓶，注意瓶裝培養(yǎng)基溫度要降到28℃以下才可接種。

②點燃酒精燈，各種接種工具先經(jīng)火焰灼燒滅菌。

③在酒精燈上方10厘米無菌區(qū)輕輕拔下棉塞，立即將試管口傾斜，用酒精燈火焰封鎖，防止雜菌侵入管內(nèi)，用消毒過的接種鉤伸入菌種試管，在試管壁上稍停留片刻使之冷卻，以免燙死菌種，按無菌操作要求將試管斜面菌種橫向切割6～8塊。

④在酒精燈上方無菌區(qū)內(nèi)，將待接菌瓶封口打開，用接種鉤取分割好的菌塊，輕輕放入原種瓶內(nèi)，立即封好口，一般每支母種可接5～6瓶原種。

2）栽培種接種：

①接種前檢查原種棉塞和瓶口的菌膜上是否染有雜菌，如果有污染的應(yīng)棄之不用。

②打開原種封口，灼燒瓶口和接種工具，剝?nèi)ピN表面的菌皮和老化菌種。

③如果是雙人接種，可一人負(fù)責(zé)拿菌種瓶，用接種鉤接種，另一人負(fù)責(zé)打開栽培種的瓶口或袋口，然后封好口。

④接種的菌種不可扒得太碎，最好呈蠶豆粒或核桃粒狀，以利于發(fā)菌。

⑤接種后迅速封好瓶口。1瓶谷粒種接種不應(yīng)超過50瓶（袋），木屑種、草料種不應(yīng)超過35瓶（袋）。

⑥接種結(jié)束后，及時將臺面、地面收拾干凈，并用5%石炭酸水溶液噴霧消毒，關(guān)閉室門。

4.培養(yǎng)

（1）培養(yǎng)室消毒 接種后的菌瓶（袋）在進(jìn)入培養(yǎng)室前，要對培養(yǎng)室進(jìn)行消毒滅菌。

（2）菌種培養(yǎng) 原種和栽培種在培養(yǎng)初期，要將溫度控制在25～28℃。在培養(yǎng)中后期，將溫度調(diào)低2～3℃。因為菌絲生長旺盛時，新陳代謝放出熱量，瓶（袋）內(nèi)溫度要比室溫高出2～3℃，如果溫度過高會導(dǎo)致菌絲生長纖弱、老化。在菌種培養(yǎng)25～30天后，要采取降溫措施，減緩菌絲的生長速度，從而使菌絲整齊、健壯。一般30～40天菌絲可吃透培養(yǎng)料，然后把溫度稍微降低一些，緩沖培養(yǎng)7～10天，使菌種進(jìn)一步成熟。

（3）污染檢查 接種后7～10天，每隔2～3天逐瓶檢查1次，發(fā)現(xiàn)雜菌立即挑出，拿出培養(yǎng)室，妥善處理，以防引起大面積污染。