二、液相色譜技術在食品安全領域的應用

（一）嬰幼兒食品中維生素K1的測定（參考GB 5009.158—2016）

1.背景簡介

維生素K是具有葉綠醌生物活性的一類物質。有維生素K1、維生素K2、維生素K3、維生素K4等幾種形式，其中維生素K1為從綠色植物中提取的維生素，是天然存在的脂溶性維生素，在日常食品中廣泛存在，維生素K2為腸道細菌（如大腸桿菌）合成的維生素。維生素K與肝臟合成四種凝血因子（凝血酶原、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ及凝血因子Ⅹ）密切相關，一旦缺乏維生素K，則肝臟合成的上述四種凝血因子為異常蛋白質分子，它們催化凝血作用的能力就會下降。而且維生素K是谷氨酸γ-羧化反應的輔助因子，維生素K的缺乏會導致上述凝血因子的γ-羧化無法正常進行，從而出現凝血時間延長，嚴重者會流血不止，甚至死亡。通常情況下，成人每日對維生素K的需求量為60～80μg。由于該類物質在食品中廣泛存在，且體內腸道細菌也能合成，一般不會缺乏，但對于新生兒而言，由于維生素K無法通過胎盤，且新生兒腸道內無細菌，食品攝入種類單一，可能會出現維生素K的缺乏癥。但是由于維生素K攝入過量也會導致貧血等癥狀，所以，食品安全國家標準——嬰兒配方食品（GB 10765—2010）中規定了維生素K1含量為1.0～6.5μg/100kJ。因此，為了保障嬰幼兒食品的質量，保護嬰幼兒的健康，有必要對相應食品中的維生素K含量進行檢測。

2.方法的選擇

鑒于食品中的維生素K大多為來自植物源產品的維生素K1，故檢測時主要針對維生素K1。目前，食品中維生素K1的測定方法主要有分光光度法、薄層色譜法、HPLC法和LC-MS/MS法等。其中分光光度法和薄層色譜法的分析過程煩瑣，測定精密度較差，只適合粗略的分析，無法準確定性定量，應用極少。HPLC和LC-MS/MS是當前食品中維生素K1測定的主流方法，兩者的靈敏度和定量能力均可滿足測定的要求，LC-MS/MS雖然在定性分析上更為出色，但其價格較為昂貴，在應用的推廣上不如HPLC，所以在食品中維生素K1的檢測領域，HPLC法的應用更為普遍。

HPLC法檢測維生素K1時可以采用多種檢測器，如紫外檢測器、二極管陣列檢測器和熒光檢測器等，但熒光檢測器的靈敏度更高，因此GB 5009.158中第一法選擇了液相色譜配熒光檢測器進行檢測。該方法對于嬰幼兒食品及乳品、植物油中維生素K1的定量限為5μg/100g。樣品首先經脂肪酶和淀粉酶酶解，由正己烷提取樣品中的維生素K1，借助C18液相色譜柱將維生素K1與其他雜質分離，由鋅柱柱后還原，熒光檢測器檢測，外標法定量。

3.提取方法

對于米粉、奶粉等粉狀樣品，經混勻后直接取樣；對于片狀、顆粒狀樣品，經樣本粉碎機磨成粉，貯存于樣品袋中備用；對于液態乳、植物油等液態樣品，搖勻后直接取樣。

稱取試樣1～5g（精確到0.01g，確保維生素K1含量不低于0.05μg）于50mL離心管中，加入5mL溫水溶解（液體樣品直接吸取5mL，植物油不需加水稀釋），加入5mL pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻，加入0.2g脂肪酶和0.2g淀粉酶（不含淀粉的樣品可以不加淀粉酶），加蓋，渦旋2～3min，混勻后置于（37±2）℃恒溫水浴振蕩器中振蕩2h以上，使其充分酶解。

取出酶解好的試樣，分別加入10mL乙醇及1g碳酸鉀，混勻后加入10mL正己烷和10mL水，渦旋或振蕩提取10min，6000r/min離心5min，或將酶解液轉移至150mL的分液漏斗中萃取提取，靜置分層（如發生乳化現象，可適當增加正己烷或水的加入量，以排除乳化現象）。轉移上清液至100mL旋蒸瓶中，向下層液再加入10mL正己烷，重復操作一次，合并上清液至上述旋蒸瓶中。

將上述正己烷提取液旋蒸至干（如有殘液，可用氮氣輕吹至干），用甲醇轉移并定容至5mL容量瓶中，搖勻，0.22μm濾膜過濾，濾液待進樣。

注意事項：由于維生素K1易分解，整個前處理過程盡量避免紫外光直射，并盡可能避光操作。可直接購買商品鋅還原柱，也可自行裝填。裝柱時，應連續少量多次將鋅粉裝入柱中，邊裝邊輕輕拍打，以使裝入的鋅粉緊密。鋅還原柱接入儀器前，須將液相色譜儀所用管路中的水排干。

4.液相色譜檢測方法

采用C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）和鋅還原柱（4.6mm×50mm）。流動相由900mL甲醇與100mL四氫呋喃混合組成，并含0.3mL冰醋酸、1.5g氯化鋅和0.5g無水乙酸鈉。流速為1mL/min。熒光檢測器的激發波長為243nm，發射波長為430nm，進樣量為10μL。在相同色譜條件下，將制備的空白溶液和試樣溶液分別進樣，進行高效液相色譜分析。以保留時間定性，峰面積外標法定量（圖1-29）。

5.定量結果計算

依據標準系列溶液所得的標準曲線對試樣溶液中目標物的質量濃度進行計算，按照如下公式計算最終樣品中目標物的含量：

式中　X——試樣中維生素K1的含量，μg/100g；

ρ——由標準曲線得到的試樣溶液中維生素K1的濃度，ng/mL；

V1——提取液總體積，mL；

V2——分取的提取液體積（嬰幼兒食品和乳品、植物油V1=V2），mL；

V3——定容液的體積，mL；

100——換算系數；

m——試樣的稱樣量，g；

1000——將濃度單位由ng/mL換算為μg/mL的換算系數。

6.應用特點

與紫外檢測器及二極管陣列檢測器相比，采用熒光檢測器的檢測靈敏度更高，特異性更強。整體而言，本方法準確，靈敏度高，流動相體系簡單，對儀器要求不高，可以滿足對維生素K1的檢測需求。其結果對維生素K1的研究具有直接指導作用，為人群維生素K1的營養狀況提供基礎數據。

（二）水產品中甲氧芐啶殘留量的測定（參考GB 29702—2013）

1.背景介紹

甲氧芐啶（trimethoprim，簡稱TMP）為廣譜抗菌藥，抗菌譜與磺胺藥類似，有抑制二氫葉酸還原酶的作用，但細菌較易對其產生耐藥性，所以甲氧芐啶通常不單獨作為抗菌藥使用，常與磺胺類藥物同時使用。研究表明，甲氧芐啶與磺胺藥合用可使抗菌作用增強數倍至數十倍。目前，該品主要作為磺胺類藥的增效藥在養殖產業中廣泛應用，可治療水生動物的豎鱗、赤皮、爛鰓、疥瘡等細菌性疾病，也可治療禽類大腸桿菌引起的敗血癥、雞白痢、禽傷寒、霍亂、呼吸系統繼發性細菌感染和球蟲病等。但由于其會在水產品體內產生藥物殘留，通過食物富集，繼而危及人體健康，國內外都制定了嚴格的限量標準，歐盟和我國均規定在魚類肌肉和皮中甲氧芐啶的最大殘留限量為50μg/kg。

2.方法的選擇

常用的甲氧芐啶檢測方法有微生物檢驗法、酶聯免疫檢測法、HPLC和LC-MS/MS法等。其中微生物法是一種初篩方法，不能具體區分殘留抗生素的種類；酶聯免疫法雖然檢測靈敏度高，但存在干擾和假陽性，且定性較為困難；LC-MS/MS定性、定量準確，但操作和維護費用高，推廣普及率不高；而液相色譜法操作簡單，定量準確，分離能力強，目前在甲氧芐啶的實際檢測中應用最為廣泛。

GB 29702—2013采用HPLC法對魚（包括鰻鱺）、蝦、蟹和龜鱉等水產品可食組織中甲氧芐啶的殘留量進行檢測，方法的定量限為20μg/kg。該法用三氯甲烷和酸性甲醇溶液提取樣品中的甲氧芐啶，再以二氯甲烷反萃取，由混合強陽離子交換固相萃取（MCX）柱凈化，高效液相色譜-紫外測定，外標法定量。

3.提取方法

稱取約5g試樣（精確至0.01g），置于50mL具塞離心管中，加入15mL三氯甲烷、14mL甲醇、6mL 0.1mol/L硫酸溶液，渦旋混合2min，4000r/min離心3min，取上清液于150mL分液漏斗中。殘渣中加甲醇14mL和0.1mol/L硫酸溶液6mL，重復提取一次，合并兩次上清液于分液漏斗中；加2mol/L氫氧化鉀溶液2mL、二氯甲烷30mL，振搖2min，靜置分層，取下層液于茄形瓶中，分液漏斗中加二氯甲烷30mL重復提取一次，合并兩次下層液；于40℃旋轉蒸發至近干，用5%乙酸溶液6mL溶解殘余物，待凈化。

MCX陽離子交換柱依次用甲醇6mL和5%乙酸溶液6mL活化，取備用液過柱，用5%乙酸溶液6mL和甲醇6mL淋洗，用氨水甲醇溶液15mL洗脫，于40℃旋轉蒸發至近干，用流動相1.0mL溶解殘余物，濾膜過濾，供高效液相色譜測定。

4.液相色譜檢測方法

采用ZORBAX-C18色譜柱（250mm×4.6mm，粒徑5μm）。流動相為甲醇+0.5%高氯酸溶液（體積比30+70），等梯度洗脫，流速1.0mL/min；柱溫35℃；進樣量20μL；檢測波長230nm。取試樣溶液和相應的標準溶液，作單點或多點校準，按外標法，以峰面積計算。標準溶液及試樣溶液中甲氧芐啶響應值應在儀器檢測的線性范圍之內。

5.定量結果計算

試樣中甲氧芐啶殘留量計算公式：

式中　X——試樣中甲氧芐啶的殘留量，μg/g；

c——試樣溶液中甲氧芐啶的濃度，μg/mL；

V——最終定容體積，mL；

m——供試試料質量，g。

6.應用特點

與其他方法相比，本方法的前處理過程通過pH的轉換，分別在酸性和堿性條件下進行提取，大部分雜質在這兩步被去除，然后再配合MCX柱凈化，進一步去除了陰離子形式存在的雜質，故最終的色譜分離中目標物的干擾會比較少。圖1-30中目標物的出峰情況證實了這種前處理過程的有效性。當然，這種多步驟的萃取和凈化對目標物帶來的損失也是不可忽略的，但考慮到本方法的定量限為20μg/kg，最終的回收率在70%～110%，符合殘留分析的要求。

（三）乳制品中牛磺酸的測定（參考GB 5009.169—2016）

1.背景簡介

牛磺酸的化學名為2-氨基乙磺酸（2-aminoethansulfonic acid），化學式為C2H7NSO3），是一種含硫β-氨基酸，廣布于動物組織之中。研究表明，牛磺酸具有廣泛的生理功能，是調節機體正常生理功能的重要活性物質，在實際生產和日常生活中具有廣泛的應用價值。一般認為，機體內的牛磺酸一部分與膽酸結合組成牛磺膽酸，起著促進脂類及其相關物質的消化吸收的生理功能。同時，牛磺酸也是神經傳遞體、抗氧化劑和膜保護劑、鈣離子內環境的穩定調節劑，對于促進大腦發育、增強視力、調節神經組織的興奮性、增加心肌收縮力等具有重要的意義。對于新生兒而言，體內合成牛磺酸的酶系尚未成熟，如果在奶粉中添加接近母乳水平的牛磺酸，就能有效保障嬰幼兒的身體發育。因此，目前國內外均將牛磺酸作為重要的食品添加劑使用，尤其規定在嬰幼兒食品中必須添加一定量的牛磺酸。但是，若補充過量的牛磺酸，就會抑制體內其他營養元素的吸收。因此，為了有效評價乳制品的品質，從根本上保障嬰幼兒食品的安全，有必要對乳制品中牛磺酸的含量進行測定。

2.方法的選擇

國內外有關牛磺酸檢測方法主要有酸堿滴定法、分光光度法、薄層色譜法、熒光法、液相色譜法、氨基酸分析儀測定法等。酸堿滴定法是我國1993年制定的牛磺酸國標測定方法，此方法簡便易行，原理簡單，但靈敏度及準確度均較低，且測定過程中干擾較多，樣品的差別較大。分光光度法和薄層色譜法的檢測靈敏度較低；熒光法對前處理要求比較高；氨基酸分析儀測定法檢測成本高，耗時長，不利于完成大批量的檢測任務。高效液相色譜法具有樣品前處理簡單、靈敏度和準確度較高、耗時短等優點，在牛磺酸的實際檢測中獲得廣泛的應用。我國2016版國標中刪除了薄層色譜法，將檢測方法均改為HPLC法。

GB 5009.169—2016食品中牛磺酸的測定中第一法和第二法為液相色譜法。其中，第一法用水溶解試樣，用偏磷酸沉淀蛋白，經超聲波振蕩提取、離心、微孔膜過濾后，通過鈉離子色譜柱分離，并與鄰苯二甲醛（OPA）發生衍生反應，用熒光檢測器進行檢測，外標法定量，定量限為0.5mg/100g。第二法用水溶解試樣，用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白質。取上清液用丹磺酰氯衍生反應，衍生物經C18反相色譜柱分離。用紫外檢測器（254nm）或熒光檢測器（激發波長330nm；發射波長530nm）檢測，外標法定量，熒光檢測法的定量限為0.1mg/100g，紫外檢測法的定量限為5mg/100g。

3.鄰苯二甲醛（OPA）柱后衍生法

（1）提取方法　對于固體試樣，稱取1～5g（精確至0.01g）于錐形瓶中，加入40℃左右溫水40mL，搖勻使試樣溶解，放入超聲波振蕩器中超聲提取10min。再加50mL偏磷酸溶液，充分搖勻。放入超聲波振蕩器中超聲提取10～15min，取出冷卻至室溫后，移入100mL容量瓶中，用水定容至刻度并搖勻，樣液在5000r/min條件下離心10min，取上清液經0.45μm微孔膜過濾，接取中間濾液以備進樣。

對于液體試樣，稱取試樣約5～30g（精確至0.01g）于錐形瓶中，加50mL偏磷酸溶液，充分搖勻。放入超聲波振蕩器中超聲提取10～15min，取出冷卻至室溫后，移入100mL容量瓶中，用水定容至刻度并搖勻。樣液在5000r/min條件下離心10min，取上清液經0.45μm微孔膜過濾，接取中間濾液以備進樣。

對于乳飲料試樣，稱取5～30g試樣（精確至0.01g）于錐形瓶中，加入40℃左右溫水30mL，充分混勻，置超聲波振蕩器上超聲提取10min，冷卻到室溫。加1.0mL亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混合，再加入1.0mL乙酸鋅溶液，渦旋混合，轉入100mL容量瓶中用水定容至刻度，充分混勻，樣液于5000r/min下離心10min，取上清液經0.45μm微孔膜過濾，接取中間濾液以備進樣。

（2）儀器檢測方法　采用鈉離子氨基酸分析專用色譜柱（25cm×4.6mm），流動相為pH3.2的檸檬酸三鈉溶液，流速為0.4mL/min，柱溫55℃。熒光衍生溶劑（鄰苯二甲醛溶液）的流速為0.3mL/min。熒光檢測器的激發波長為338nm，發射波長為425nm。進樣量為20μL。將試樣溶液和系列標準溶液順次進樣，以色譜峰高或峰面積結合標準曲線計算待測溶液中牛磺酸的濃度（圖1-31）。

4.丹磺酰氯柱前衍生法

（1）提取方法

① 對于固體試樣，稱取1～5g（精確至0.01g）于錐形瓶中，加入40℃左右溫水40mL，搖勻使試樣溶解，放入超聲波振蕩器中超聲提取10min。冷卻到室溫，加1.0mL亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混合，再加入1.0mL乙酸鋅溶液，渦旋混合，轉入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，充分混勻。樣液于5000r/min下離心10min，取上清液備用。

② 對于液體試樣，稱取5～30g（精確至0.01g）于錐形瓶中，加20mL水，充分搖勻。加1.0mL亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混合，再加入1.0mL乙酸鋅溶液，渦旋混合，轉入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，充分混勻。樣液于5000r/min下離心10min，取上清液備用。

③ 對于乳飲料試樣，稱取5～40g試樣（精確至0.01g）于錐形瓶中，加入40℃溫水20mL，充分混勻，置超聲波振蕩器上超聲提取10min，冷卻到室溫。加1.0mL亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混合，再加入1.0mL乙酸鋅溶液，渦旋混合，轉入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，充分混勻。樣液于5000r/min下離心10min，取上清液備用。

提取說明：牛磺酸為易溶于水的兩性化合物，并且常以游離態存在于樣品中，因此水能完全提取奶粉中牛磺酸，而采用加熱和超聲輔助萃取樣品時提取效果更佳。但由于部分乳制品呈乳濁液，為去除溶液中乳狀體，所以需要加入沉淀蛋白試劑。

（2）柱前衍生　準確吸取1.00mL提取所得上清液到10mL具塞玻璃試管中，加入1.00mL碳酸鈉緩沖液和1.00mL丹磺酰氯溶液，充分混合，于室溫避光衍生反應2h（1h后需搖晃1次），然后加入0.10mL鹽酸甲胺溶液，渦旋混合以終止反應，避光靜置至沉淀完全。取上清液經0.45μm微孔濾膜過濾，待測。

注意：系列標準溶液必須與試樣溶液同步進行衍生。

（3）儀器檢測方法　采用C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙酸鈉緩沖液+乙腈（體積比70+30），流速為1.0mL/min，柱溫為室溫。熒光檢測器的激發波長330nm，發射波長530nm。若使用紫外檢測器或二極管陣列檢測器，則檢測波長254nm。進樣量20μL。色譜結果見圖1-32、圖1-33。

5.定量結果計算

試樣中牛磺酸含量按下式計算：

式中　A——試樣中牛磺酸的含量，mg/100g；

c——試樣測定液中牛磺酸的濃度，μg/mL；

V——試樣定容體積，mL；

m——試樣質量，g。

6.應用特點

牛磺酸同許多氨基酸一樣，其分子式中沒有共軛結構，故其紫外吸收和熒光發射都比較弱。當樣品中牛磺酸含量較低時，需要對其進行衍生化反應，即在其結構中加入紫外吸光基團，才能滿足液相色譜儀檢測器（如紫外檢測器或熒光檢測器）的靈敏度要求。在應用中涉及了衍生的兩種方式：柱前衍生和柱后衍生，為不同實驗室根據自身條件進行選擇提供了便利。并且，兩種衍生法的定量限在0.1～5mg/100g之間，均可實現乳制品中牛磺酸含量的準確測定。

（四）食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的檢測方法（參考GB 5009.28—2016）

1.背景簡介

苯甲酸（C7H6O2）又稱安息香酸，是苯環上的一個氫被羧基（-COOH）取代形成的化合物。由于苯甲酸有抑制真菌、細菌、霉菌生長的作用，苯甲酸及其鈉鹽作為食品添加劑在乳膠、牙膏、果醬或其他食品中有廣泛的應用。苯甲酸及其鈉鹽本身具有一定的刺激性，但在人體和動物組織中可與蛋白質成分的甘氨酸結合形成馬尿酸，從而不會危害人體。然而，若過量攝入，不僅能破壞維生素B1，還能使鈣形成不溶性物質，影響人體對鈣的吸收，同時對胃腸道有刺激作用，可誘發癌癥、哮喘、蕁麻疹及血管性水腫等變態反應。近年來的研究還表明，當苯甲酸（鈉）與維生素C混合后，會生成化合物苯，而苯可以影響細胞的線粒體，并且造成細胞死亡。因此，目前國內外都對食品中苯甲酸及其鈉鹽的使用有嚴格的限定。

山梨酸是一種不飽和脂肪酸，能有效地抑制霉菌、酵母菌和好氧性細菌的活性，能防止肉毒桿菌、葡萄球菌、沙門菌等有害微生物的生長和繁殖，在食品工業中是一種重要的防腐劑。從安全性方面來講，山梨酸在人體內參與新陳代謝過程，并被人體消化和吸收，產生二氧化碳和水，較為安全。但是如果食品中添加的山梨酸超標嚴重，消費者長期服用，在一定程度上會抑制骨骼生長，危害腎、肝臟的健康。

糖精鈉是鄰苯甲酰磺酰亞胺（糖精）的鈉鹽，其甜度比蔗糖甜300～500倍，是食品工業中常用的合成甜味劑。但糖精鈉是一種食品添加劑，除了在味覺上可以引起甜的感覺外，對人體無任何營養價值，而且一旦食用較多糖精鈉，會影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，若短時間內食用大量糖精，還會引起血小板減少而造成急性大出血、多臟器損害等。自2005年以來，糖精在食品中的應用有明顯的超范圍、超量現象，一些廠商為了降低成本賺取暴利，在飲料、果脯甚至專供兒童消費的果凍等食品中，普遍使用對人體有害無益的糖精來代替蔗糖，但在食品標簽上卻不作任何明示，或冠以“蛋白糖”“甜寶”等美名掩蓋使用糖精的事實，損害了消費者的身體健康，嚴重侵犯了消費者的知情權，已引起了社會各界和廣大消費者的密切關注。

綜上所述，苯甲酸、山梨酸和糖精鈉都是目前食品工業中應用較為廣泛的食品添加劑，但在過量使用的情況下，都會對人體產生危害，因此對食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉進行檢測是食品安全領域的一個重點。

2.方法的選擇

苯甲酸、山梨酸都屬于防腐劑，兩者的檢測方法較為接近，主要有薄層色譜、分光光度法、氣相色譜法和HPLC等。而糖精鈉屬于甜味劑，可以用薄層色譜法、硫代二苯胺比色法、分光光度法和HPLC等。本應用中要將三種物質同時進行檢測，由于糖精鈉無法用氣相色譜法檢測，故不宜采用；薄層色譜法和分光光度法靈敏度較差，定型能力弱，不適用，因此HPLC法在本應用情況中最為合適，并且操作簡單，定量準確。HPLC目前也是我國食品添加劑檢測標準中的常用方法。

GB 5009.28—2016規定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉測定的方法，方法的定量限均為0.01g/kg。方法以水對樣品中的目標物進行提取，對高脂肪樣品經正己烷脫脂，高蛋白樣品經蛋白沉淀劑沉淀蛋白，采用液相色譜分離、紫外檢測器檢測，外標法定量。

3.提取方法

對于一般性試樣，稱取約2g（精確到0.001g）試樣于50mL具塞離心管中，加水約25mL，渦旋混勻，于50℃水浴超聲20min，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液2mL和乙酸鋅溶液2mL，混勻，于8000r/min離心5min，將水相轉移至50mL容量瓶中，于殘渣中加水20mL，渦旋混勻后超聲5min，于8000r/min離心5min，將水相轉移到同一50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過0.22μm濾膜，待液相色譜測定。

對于含膠基的果凍、糖果等試樣，稱取約2g（精確到0.001g）試樣于50mL具塞離心管中，加水約25mL，渦旋混勻，于70℃水浴加熱溶解試樣，50℃水浴超聲20min，然后按照如上操作進行。

對于油脂、巧克力、奶油、油炸食品等高油脂試樣，稱取約2g（精確到0.001g）試樣于50mL具塞離心管中，加正己烷10mL，于60℃水浴加熱約5min，并不時輕搖以溶解脂肪，然后加氨水溶液（1+99）25mL、乙醇1mL，渦旋混勻，于50℃水浴超聲20min，冷卻至室溫后，加亞鐵氰化鉀溶液2mL和乙酸鋅溶液2mL，混勻，于8000r/min離心5min，棄去有機相，水相轉移至50mL容量瓶中，殘渣再提取一次后測定。

4.儀器檢測方法

采用C18色譜柱，柱長250mm，內徑4.6mm，粒徑5μm。流動相為甲醇+乙酸銨溶液（5+95），流速1mL/min，進樣量10μL，檢測波長230nm。當存在干擾峰或需要輔助定性時，可以采用加入甲酸的流動相來測定，如以甲醇+甲酸-乙酸銨溶液（8+92）作流動相。液相色譜圖見圖1-34、圖1-35。

圖1-34　1mg/mL苯甲酸、山梨酸和糖精鈉標準溶液的液相色譜圖
（流動相：甲醇+乙酸銨=5+95）

圖1-35　1mg/mL苯甲酸、山梨酸和糖精鈉標準溶液的液相色譜圖
（流動相：甲醇+甲酸-乙酸銨溶液=8+92）

采用上述色譜條件分別對標準系列溶液、試樣溶液和空白試驗溶液進樣檢測。

5.定量結果計算

依據得到的試樣溶液的峰面積，根據標準曲線得到待測液中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉（以糖精計）的質量濃度，按照如下公式計算最終樣品中目標物的含量：

式中　X——試樣中待測組分含量，g/kg；

ρ——由標準曲線得出的試樣液中待測物的質量濃度，mg/L；

V——試樣定容體積，mL；

m——試樣質量，g；

1000——換算因子。

6.應用特點

添加劑使用不規范、超量、超范圍使用是影響食品安全的重大隱患。但由于食品添加劑種類繁多，數量龐大，實現快速、高通量的多殘留檢測是檢測技術發展的趨勢。苯甲酸、山梨酸和糖精鈉三種常見的食品添加劑用統一方法進行檢測是本應用的特點，其有效地利用HPLC法高效的物質分離能力，對兩種類別的食品添加劑同時進行檢測，整個方法簡單易行，靈敏度高，穩定性好，推廣使用的潛力大。

（五）食品中黃曲霉毒素的測定（參考GB 5009.22—2016）

1.背景簡介

黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉和特曲霉等產生的有毒代謝產物，當糧食未能及時曬干及貯藏不當時，往往容易被黃曲霉或寄生曲霉污染而產生此類毒素。黃曲霉毒素主要包括黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2以及黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2，其中黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2是黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2在奶牛體內代謝產生的。黃曲霉毒素在農產品中幾乎無法避免，而花生和玉米則是最容易被黃曲霉污染的糧食。1960年英國曾發生10萬只火雞因食用產生了黃曲霉毒素的花生粕飼料而死亡的事件。1993年世界衛生組織的癌癥研究機構將黃曲霉毒素劃定為一類致癌物，其危害性在于對人及動物肝臟組織有極強的破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡，在天然污染的食品中黃曲霉毒素B1通常被認為具有最強的毒性和致癌性。黃曲霉毒素目前已發現20余種，主要污染糧油食品、動植物食品等，如花生、玉米、大米、小麥、豆類、堅果類、肉類、乳及乳制品、水產品等均有黃曲霉毒素污染的風險，因此，對食品中黃曲霉毒素進行測定是食品安全的一個重要課題。

2.方法的選擇

黃曲霉毒素測定的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附測定法、質譜法、放射免疫測定法。這些方法中，“免疫親和柱凈化”是眾多方法均采用的一個步驟，而由此衍生的快速篩選法（酶聯免疫吸附測定法等）也是現在國際公認的比較經濟有效的初篩方法。但從方法定性、定量和實際應用的要求考慮，免疫學方法在定性上略有不足，質譜法的儀器相對昂貴，無法在基層大量推廣。因此，就有效應用而言，液相色譜法無疑是目前國內外測定黃曲霉毒素的重要手段。

我國的食品安全國家標準GB 5009.22—2016中的第二法和第三法均為液相色譜法，其中第二法為高效液相色譜-柱前衍生法，第三法為高效液相色譜-柱后衍生法，兩者的適用范圍包括谷物及其制品、豆類及其制品、堅果及籽類、油脂及其制品、調味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品。上述方法通過乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取試樣中的黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2，提取液經黃曲霉毒素固相凈化柱或免疫親和柱凈化，去除脂肪、蛋白質、色素及碳水化合物等干擾物質，用三氟乙酸柱前衍生，液相色譜分離，熒光檢測器檢測，外標法定量；或者經液相色譜分離，柱后衍生（碘或溴試劑衍生、光化學衍生、電化學衍生等），經熒光檢測器檢測，外標法定量。

3.提取方法

對于植物油脂類液體樣品，稱取5g試樣（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入20mL乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質器均質3min），在6000r/min下離心10min，取上清液備用。

對于醬油和醋，稱取5g試樣（精確至0.01g）于50mL離心管中，用乙腈或甲醇定容至25mL（精確至0.1mL），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質器均質3min），在6000r/min下離心10min（或均質后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。

對于一般固體樣品，稱取5g試樣（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入20.0mL乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質器均質3min），在6000r/min下離心10min（或均質后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。

對于嬰幼兒配方食品及輔助食品，稱取5g試樣（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入20.0mL乙腈-水溶液（50+50）或甲醇-水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質器均質3min），在6000r/min下離心10min（或均質后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。

對于半流體樣品，稱取5g試樣（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入20.0mL乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質器均質3min），在6000r/min下離心10min（或均質后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。

若采用專用固相萃取柱凈化-柱前衍生法，則移取適量上述提取過程的上清液，按黃曲霉毒素專用固相萃取凈化柱的要求進行凈化，收集全部凈化液。用移液管準確吸取4.0mL凈化液于10mL離心管后在50℃下用氮氣緩緩地吹至近干，分別加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，渦旋30s，在40℃±1℃的恒溫箱中衍生15min，衍生結束后，在50℃下用氮氣緩緩地將衍生液吹至近干，用初始流動相定容至1.0mL，渦旋30s溶解殘留物，過0.22μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中，以備進樣。

若采用免疫親和柱凈化-柱后衍生法，則將上述樣液移至50mL注射器筒中，調節下滴速度，控制樣液以1～3mL/min的速度穩定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內加入2×10mL水，以穩定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統，在親和柱下部放置10mL刻度試管，取下50mL的注射器筒，2×1mL甲醇洗脫親和柱，控制1～3mL/min的速度下滴，再用真空泵抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，用初始流動相定容至1.0mL，渦旋30s溶解殘留物，0.22μm濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

注意事項：免疫親和柱需要按要求進行保存，在質量品質上要求AFTB1的柱容量≥200ng，AFTB1的柱回收率≥80%，AFTG2的交叉反應率≥80%。尤其需要關注不同批次間免疫親和柱的質量差異，務必通過驗證方法進行驗證。

4.液相色譜檢測方法

采用柱前衍生法時，以水（A）和乙腈-甲醇溶液（B，50+50）作為流動相，用梯度洗脫程序進行目標物洗脫：24%B（0～6min），35%B（8.0～10.0min），100%B（10.2～11.2min），24%B（11.5～13.0min）；用C18柱（柱長150mm或250mm，柱內徑4.6mm，填料粒徑5.0μm）或相當者作為色譜分析柱；流速1.0mL/min；柱溫40℃；進樣體積50μL；檢測波長為激發波長360nm，發射波長440nm（圖1-36、圖1-37）。

采用柱后衍生法時，可以應用多種方法對目標物進行衍生，以電化學柱后衍生為例，液相色譜參考條件如下：

① 流動相：A相為水（1L水中含119mg溴化鉀，350μL 4mol/L硝酸）；B相為甲醇。

② 等梯度洗脫條件：A，60%；B，40%。

③ 色譜柱：C18柱（柱長150mm或250mm，柱內徑4.6mm，填料粒徑5μm），或相當者。

④ 柱溫40℃。

⑤ 流速1.0mL/min。

⑥ 進樣量50μL。

⑦ 電化學柱后衍生器：反應池工作電流100μA；1根PEEK反應管路（長50cm，內徑0.5mm）。

⑧ 激發波長360nm；發射波長440nm。

5.定量結果計算

依據標準系列溶液所得的標準曲線對試樣溶液中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的含量進行計算，按照如下公式計算最終樣品中目標物的含量：

式中　X——試樣中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2的含量，μg/kg；

ρ——進樣溶液中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2按照外標法在標準曲線中對應的濃度，ng/mL；

V1——試樣提取液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），mL；

V3——樣品經免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，mL；

V2——用于免疫親和柱的分取樣品體積，mL；

m——試樣的稱樣量，g。

6.應用特點

用液相色譜法檢測食品中黃曲霉毒素快速、準確，在實際領域應用較廣。相比于質譜法的定量精準和定性準確，液相色譜法提供了定性基本準確，但更加寬泛的選擇性，如多達5種的不同衍生方式為基質具體操作人員提供了極大的便利。