第二節　高效液相色譜儀器的基本結構及發展

一、高效液相色譜儀器的基本組成

自1969年首次出現以來，隨著應用范圍的不斷拓展，高效液相色譜（簡稱HPLC）儀器的發展十分迅猛，其儀器結構和流程也多種多樣。典型的高效液相色譜儀基本由高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統五個部分組成，如圖1-2所示。下面將分別敘述其各自的組成與特點。

（一）高壓輸液系統

HPLC使用的色譜柱是很細的（1～6mm），所用固定相的粒度也非常?。◣孜⒚椎綆资⒚祝粤鲃酉嘣谥辛鲃邮艿降淖枇艽螅诔合?，流動相流速十分緩慢，柱效低且費時。為了達到快速、高效分離，必須給流動相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動速度，因此，須用高壓泵進行高壓輸液。所以高壓輸液系統對于現代HPLC而言是至關重要的。高壓液相色譜儀的高壓輸液系統通常由過濾器、貯液裝置、脫氣裝置、高壓泵、壓力脈動阻尼器、梯度淋洗裝置等組成。

1.過濾器

在HPLC體系中一旦有任何顆粒物進入，都會對高壓泵或單向閥造成損害，并堵塞輸液管路或色譜柱，最終導致系統壓力增加并使色譜峰變形。因此，為了防止或減少顆粒物進入HPLC系統中，延長儀器和色譜柱的使用壽命，提高數據的可靠性，在流動相進入HPLC系統前通常需要經過過濾器。常用過濾裝置是孔徑為5～10μm的下沉式過濾器，位于連接貯液瓶和泵的輸液管的末端進口處，常見材質有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬過濾筒兩種。

注意事項：過濾器的設計只能除去系統中的塵土并保證貯液瓶、輸液管使用的可靠性，并不能取代流動相的過濾步驟。如果流動相均由高效液相色譜級的溶劑組成，那么，流動相可以不用過濾。由于高效液相色譜級的有機溶劑，例如乙腈、甲醇等，在制造的工藝過程中都已經過了0.2μm微孔濾膜過濾。同樣的，無論是HPLC級的水還是在實驗室使用超純水凈化系統制備的水，最后一步也是通過0.2μm微孔濾膜。但是，假如有任何一種緩沖液中加進了固體物，例如磷酸鹽，就必須進行流動相的過濾。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能含有顆粒物質，例如在蓋試劑瓶的塑料內蓋時，塑料瓶蓋子與瓶口邊沿擠壓就會產生塑料顆粒。在這種情況下，添加的固體物可能完全溶解了，但是少量雜質顆粒仍然會存在于流動相中成為殘渣。過濾步驟通常采用流動相通過0.45μm微孔濾膜過濾進行。

2.貯液裝置

用來貯存液體流動相，一般是玻璃或不銹鋼容器，體積在0.5～2L為宜，對于凝膠色譜儀、制備型色譜儀，則體積可以更大些。貯液瓶要求能承受一定壓力，耐腐蝕，易于脫氣操作。通常貯液容器應放置于高于泵體的位置，以便保持一定的輸液壓力差。簡單的貯液容器為500mL透明或棕色試劑瓶，蓋嚴，防止溶劑揮發或空氣中氧氣等引起流動相組成發生改變。

3.脫氣裝置

流動相進泵前必須脫氣，尤其是水和極性溶劑，以除去其中溶解的氣體（如氧氣等）。否則過柱后由于壓力降低，溶解的氣體會逸出形成氣泡，這些氣泡對于多種檢測器都會造成不良的影響，如在低死體積檢測池中，氣泡會增加基線噪聲，進而降低檢測器的靈敏度，而對于熒光檢測器，溶解在流動相中的氧氣將會造成熒光猝滅效應，影響熒光檢測器的檢測。

目前，商品化的HPLC儀器一般裝有流動相在線脫氣設備，如微型真空泵在線脫氣，通常采用將真空脫氣設備串聯到貯液系統中，并結合膜過濾器的方式實現連續脫氣，以脫除溶解在液體中的空氣，防止溶解氣在柱后由于壓力下降而脫出，形成氣泡，影響檢測器正常工作。

離線的脫氣方式也經常應用，比較常見的有超聲波脫氣法、低壓脫氣、吹氦脫氣和加熱回流等。

超聲波脫氣法：將溶劑貯瓶置于超聲波水浴中，脫氣15～20min，這是目前使用最廣泛的脫氣方法。

低壓脫氣又稱為抽真空脫氣，使用微型真空泵，降壓至0.05～0.07MPa即可除去流動相中溶解的氣體，該法對單一溶劑體系脫氣較為適宜，多元溶劑建議先進行脫氣后再混合，防止真空體系對混合溶劑的組成造成影響。

吹氦脫氣法利用氦氣在液體中的溶解度小于空氣的特點，在0.1MPa壓力下，用一定流速（如60mL/min）將氦氣通入流動相10～15min，即可除去流動相中溶解的空氣。該法因使用氦氣，成本較為昂貴，但脫氣效果較好。

4.高壓輸液泵

高壓輸液泵是高效液相色譜儀中的關鍵部件之一，其功能是將貯液容器中的流動相以高壓形式連續不斷地送入液路系統，使樣品在色譜柱中完成分離過程。由于液相色譜儀所用色譜柱徑較細，所填固定相粒度很小，因此，對流動相的阻力較大，為了使流動相能較快地流過色譜柱，就需要高壓泵注入流動相。因此，HPLC系統對泵有如下要求：輸出壓力高，流量范圍大，流量恒定，無脈動，流量精度和重復性為0.5%左右，此外，還應耐腐蝕，密封性好。

高壓輸液泵，按其性質可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒流泵是能給出恒定流量的泵，其流量與流動相黏度和柱滲透無關。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統阻力不發生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。

高壓輸液泵，按機械結構可分為液壓隔膜泵、氣動放大泵、螺旋注射泵和往復柱塞泵四種，其中液壓隔膜泵和氣動放大泵為恒壓泵，而螺旋注射泵和往復柱塞泵則屬于恒流泵。

（1）液壓隔膜泵　這種泵的特點是制備工藝要求低，高壓密封易解決。缺點是排吸液切換時壓力波動較大。其結構如圖1-3所示。

（2）氣動放大泵　這種泵是輸出恒定壓力的泵，結構如圖1-4所示。其利用氣體的壓力驅動和調節流動相的壓力。工作時，以壓縮空氣作為動力驅動汽缸中橫截面積大的活塞，再經過一個連桿驅動液缸中橫截面積小的活塞，借助兩個活塞面積的差異，獲得輸出液的高壓。

使用氣動放大泵時，輸出流動相的流量不僅由泵的輸出壓力決定，還取決于流動相的黏度及色譜柱的長度、固定相粒度和填充情況，因此在實際過程中無法獲得穩定的流量。

氣動放大泵的優點是制備容易，操作時壓力穩定無波動，但由于其不易進行流量調節，無法用于梯度淋洗，目前常常用于裝柱。

（3）螺旋注射泵　這種泵為輸出恒定體積流量的流動相，其工作原理（圖1-5）是利用齒輪螺桿傳動至步進電動機，帶動活塞以恒定的速度移動，在高壓的狀態下將流動相以恒定流速輸出。

螺旋注射泵的優點為流量穩定，操作方便，可與多種高靈敏度檢測器連接使用。其可在高壓狀態下提供精確（0.1%）、無脈動、可重現的流量，并可通過改變電動機的電壓，控制電機轉速，改變活塞的移動速度，進而調節流動相的流量。這種泵的缺點是間斷式供液，更換溶劑時清洗不便，盡管可采用雙缸結構解決間歇供液的問題，但不易清洗的問題仍無法解決，目前多用于超臨界流體色譜中。

（4）往復柱塞泵　這是HPLC中應用最多的泵，其結構如圖1-6所示。常見的往復柱塞泵為雙柱塞并聯泵，通常由電動機帶動凸輪或偏心輪轉動，驅動活塞桿做往復式運動，借助單向閥的開關，定期將貯存在液缸里的液體以高壓連續輸出。需要改變輸出液體的流量時，可以通過改變電動機的轉速、調節活塞沖程的頻率來實現。

往復柱塞泵的優點在于維持高壓狀態下的連續恒定的流量，且由于柱塞尺寸小、易于密封，柱塞、單向閥的閥球和閥座可使用人造紅寶石材料，更換溶劑便利，尤其適合于梯度洗脫。其缺點在于恒流狀態下仍存在脈動，對于敏感的接測器而言，會引起基線波動；此外，柱塞直接與流動相接觸，會造成污染，且長期運轉過程中，單向閥的閥球易因磨損而不能正常關閉單向閥。

5.壓力脈動阻尼器

由于高壓輸液泵輸出的流動相具有一定脈動，而很多檢測器對流動相流速波動比較敏感，為了獲得穩定的基線，所以HPLC儀器中常常會在泵的出口與色譜柱的入口安裝一個壓力脈沖阻尼器。阻尼器由螺旋毛細管、波紋管等組成。

6.梯度淋洗裝置

通常情況下，液相色譜中的流動相組成和比例是恒定的，這種洗脫化合物的方式被稱為等度洗脫；但是為了改善分析結果，某些操作需要連續改變流動相中各溶劑組分的比例以連續改變流動相的極性，使每個分析組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有組分可在最短時間內實現最佳分離，這種洗脫方式稱為梯度洗脫。目前，梯度洗脫已在HPLC中獲得廣泛的應用，主流的儀器都配備梯度洗脫裝置。

梯度洗脫可分為低壓梯度和高壓梯度兩種方式，如圖1-7所示，具體介紹如下：

（1）低壓梯度裝置　該梯度模式又稱為泵前混合，在常壓下按照一定的程序將溶劑預先進行混合后再由高壓輸液泵輸入色譜分離系統。目前最常用的方式是通過電磁比例閥控制流動相的混合，借助控制器程序即可得到任意混合濃度的曲線。這種裝置的主要優點是僅需要一個高壓輸送泵。圖1-8是四元低壓梯度系統示意圖。這一系統最多可同時有四個流動相進入流路，按照預先設定的配比進行混合，依靠電磁閥的快速切換使泵分段輸送不同流動相，可以做梯度洗脫。在儀器上進行設定之后，在同一樣品分析過程中，相隔一段時間后，按照用戶的設定自行改變流動相配比，將樣品中組分分離開來。

低壓梯度的混合比例是通過控制不同流路的電磁閥的開閉時間長短來控制的，理論上混合的比例是準確的，但是實際上電磁閥的開閉會有一個延遲，從而對混合的比例造成影響，尤其是比例相差很大時（如99∶1），在低比例流路的電磁閥延遲的時間可能比電磁閥工作的時間還要長，就會直接影響混合的效果，這也是低壓梯度混合的缺陷。

（2）高壓梯度裝置　高壓梯度模式通常采用泵后混合，由兩個或兩個以上高壓輸液泵分別將兩路或兩路以上極性不同的溶劑輸入混合器，經充分混合后進入色譜分離系統。其優點在于不同流路的流動相各自由獨立的高壓輸液泵控制，可以獲得任何形式的梯度程序，并易于實現自動化。

與低壓梯度模式相比，泵后混合時溶劑的可壓縮性及熱力學體積的變化可能會影響輸入到色譜柱中的流動相的組成。但多個泵并聯，按照預先設定的配比分別送液到泵后的混合室內，在高壓下進行混合，混合配比更準確，不易產生氣泡，不用為了轉換流動相而反復清洗，不僅節省溶劑，也提高了工作效率，無需增加真空脫氣機，降低了混合死體積（泵前混合時、混合管、泵頭等體積，脫氣機內死體積都不可避免）。目前常見的為二元高壓梯度裝置，其適合于成分復雜的樣品分析和重現性較高的測定。

（二）進樣系統

進樣系統是將試樣送入色譜柱的裝置。依據“無限直徑效應”，如果樣品以柱塞式注入色譜柱，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴散很小，就能保持高柱效，因此在HPLC體系中強調進樣時應將樣品定量地快速注入至色譜柱上端的填料中心，形成比較集中的一點。此外，液相色譜儀進樣系統要求進樣重復性好；進樣器死體積小；由進樣引起色譜峰擴張?。幻芊庑阅芎?，不得出現泄漏、吸附、滲透，進樣時系統壓力、流量波動小等。

目前液相色譜儀進樣主要有兩種方式：一類是手動進樣；另一類是自動進樣。無論是手動還是自動進樣，一般都借助閥進樣裝置來完成進樣操作。圖1-9為常見的六通閥進樣裝置示意圖。

采用閥裝置進樣的柱效比直接加樣品在色譜柱上的方式下降5%～10%，但其重復性好，耐高壓。

自動進樣一般是將六通閥配上樣品傳送系統、取樣系統和程序控制器，由程序控制取樣針從樣品瓶中自動吸取樣品，從1處注入色譜系統，于色譜分析的同時完成洗針和復位動作。自動進樣裝置的樣品量可連續調節，進樣重復性高，適合于大量常規樣品的分析。

手動進樣閥的實物如圖1-10所示，LOAD閥位為裝填樣品狀態，注入樣品后，將閥旋轉到INJECT位置，實現進樣。樣品的注入方式一般分為滿環注入和部分注入兩種。滿環注入時，要求用比定量環體積稍多的樣品量注入環路，保證定量環滿環進樣，這種方式重現性較好。部分注入方式通常是在以定量環容量作為最大范圍的前提下，通過微量注射器定量注入所需體積的樣品量，這種方式的重現性受到微量注射器的計量誤差影響，但在注射同一濃度的標準試樣作標準曲線時應用便利。

與自動進樣相比，手動進樣在平時使用時需要特別注意操作和維護，如果使用方法不當易出現譜圖變異、標線無線性、漏液等現象。故在使用時需要注意如下事項：

① 手柄處于LOAD和INJECT之間時，由于暫時堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉到進樣位時，過高的壓力會對柱頭造成損傷，所以應盡快轉動手柄，不能停留在中途。

② 部分注入方式進樣時，進樣量一般最多為定量環容量的75%；滿環注入方式時，進樣量以能完全置換定量環內殘留的溶液量為準，一般為定量環容量的3～5倍。

③ 樣品溶液均要用濾膜過濾，防止微粒阻塞進樣閥和減少對進樣閥的磨損。

④ 注意進樣針外壁的清洗，防止交叉污染。

⑤ 每次用完后應沖洗進樣管路，通常用適當的有機溶劑、水或不含鹽的流動相沖洗，尤其是LOAD和INJECT閥位。

（三）分離系統

分離系統是HPLC的重要部分，該系統包括色譜柱、連接體系和恒溫系統組成。根據分析的目標物，選擇適合的色譜分離系統，可以提高分離效果。

1.色譜柱

（1）色譜柱的管材尺寸　色譜柱采用優質不銹鋼管、硬質玻璃管或鈦合金等材料作為管材。不銹鋼耐腐蝕、易純化、耐高壓，但其內表面光潔度對柱效影響很大。柱管內若有縱向溝痕或表面不均勻，會引起色譜峰區帶擴張，降低柱效。因此，通常需要對不銹鋼管材進行內壁拋光，并以HNO3作鈍化處理。標準填充柱的長度為10～50cm（需要兩根聯用時，可在二者之間加一連接管），柱管內徑為2～5mm，填料粒徑5～10μm，柱效達5000～10000塊/m理論塔板數。如使用3～5μm粒徑的填料，則柱長通常為5～10cm。如使用內徑為0.5～1.0mm或30～50μm柱管時，柱長為15～50cm；如果用于半制備或制備色譜，一般柱管內徑需6mm以上。

（2）色譜柱的填料　填料是色譜柱的核心，填料的品種、粒徑的形狀、大小對分離都有明顯影響。填料的粒徑一般為5～10μm，通常是由機械強度高的樹脂或硅膠構成。這些材料須具有惰性（如硅膠表面的硅酸基團基本已除去）、多孔性和比表面積大的特點，同時其表面經過機械涂漬，或者是化學鍵合各種基團（如磷酸基、季銨基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類填料對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

目前，以化學鍵合固定相的填料在HPLC中最為常見。這種填料以硅膠為基質，采用有機硅烷等與硅膠表面進行化學鍵合反應，形成Si—O—Si—C鍵型或Si—O—C鍵型。它們結構穩定，耐水，耐光，耐有機溶劑，能在70℃以下使用，pH范圍2～8，是性能最佳、應用最廣的固定相。

相比于常規涂漬固定相，化學鍵合固定相具有如下優點：

① 壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊，耐水，耐光，耐有機溶劑，穩定；

② 傳質快，表面無液坑，比一般液體固定相傳質快；

③ 選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；

④ 有利于梯度洗脫。

（3）色譜柱的填充　色譜柱填充質量的好壞直接影響填充柱的柱效，因此，色譜柱的填充方式及效果對于HPLC體系而言也是極其重要的。一根填充質量較高的色譜柱，通常其理論塔板數應該達到2000～3000塊/m，根據固定相填料粒徑的大小，可分為濕法裝柱和干法裝柱兩種。一般粒徑大于20μm的（多用于制備色譜），可用干法裝柱，而粒徑小于10μm的，由于隨著粒徑的縮小，靜電作用和表面能的加大，粒子間傾向于聚集和“黏結”，若以干法填裝，它們會黏附在連接管及柱壁上，也會因強烈的靜電作用彼此排斥，因而難以填裝出均勻而緊密的柱床。所以必須改以濕法裝填，即將填料懸浮于適宜的液體中消除上述不良作用。

干法裝柱是直接往柱管里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側，至硅膠界面不再下降為止，然后填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會使得柱子裝得很結實。接著是用淋洗劑“走柱子”。但需注意的一點是，在干法填裝制備液相色譜柱時，不要過分劇烈地振動和敲打。振動和敲打會使填料因自身粒徑的不均勻性而產生柱子整體上的不均一性，即較大的填料粒子靠近柱壁，而較細粒徑者則傾向集中于柱中心。這種柱內顆粒分布的不均勻性，會導致柱效的降低。比較好的方法是采用少量多次的方法向柱內加入填料，例如每次加入相當于3～5mm柱床的填料，裝一點即垂直地輕輕磕幾十下，續加一些填料后，重復上述操作，直至填裝完成。

濕法裝柱又稱勻漿裝填法。一般是先把硅膠填料用適當溶劑拌勻后，裝填入柱管中，然后再加壓用淋洗劑“走柱子”。濕法裝柱的關鍵在于克服在固-液系統中存在因重力而引起的沉降現象，通常采用如下三種方式：①設法尋找與硅膠密度相近的溶液，降低沉降速度；②增加液體的黏度以阻止粒子的下沉；③綜合利用前兩種方法，盡力減小沉降并盡快地在發生較顯著的沉降之前完成裝柱操作。濕法裝柱的最大優點是色譜柱裝得比較結實，沒有氣泡。

2.連接體系

色譜柱需要通過適當的連接與HPLC儀器形成完整的體系。色譜柱管與柱接頭通過過濾片連接，過濾片一般用多孔不銹鋼燒結材料，孔徑小于填料的粒徑，這樣既阻擋了流動相中的極小顆粒進入色譜柱，又能保證流動相順利通過色譜柱。

此外，為了減小死體積和色譜峰的展寬，HPLC體系中的連接管均為內徑0.1～0.3mm的不銹鋼管或PEEK管，并且應使用盡可能短及較小內徑的管路進行連接。

在色譜柱的連接中，有些體系會使用保護柱（預柱）來防止因流動相和樣品中的不溶性顆粒堵塞色譜柱的危害。這種保護柱一般連接在進樣器和色譜柱之間，裝有填料或過濾片，常被用于去除預處理過程后殘留的蛋白質、多糖等成分。如果使用有填料的保護柱，要求選擇和分析柱性能相同或相近的填料，但其對峰的保留時間會有影響。無填料的保護柱一般是利用篩板的過濾作用，效果不如有填料的保護柱。

3.恒溫器

柱溫可以影響色譜分離效率。一般情況下，提高柱溫可以降低流動相的黏度，增加樣品在流動相中的溶解度，減小溶質的保留值。常用的柱溫控制范圍為室溫至65℃之間。多數樣品在室溫條件下即可進行分析，但恒定的柱溫可以提高保留時間值的重現性，因此在室溫變化大的實驗室配置恒溫箱是很有必要的。目前，商品化的HPLC儀器的恒溫裝置多采用空氣循環箱恒溫和色譜套柱加熱恒溫。

（四）檢測系統

HPLC的檢測系統是一種信號接收和能量轉換的裝置，其通過將色譜柱中流出物的組成和含量變化轉化為可供檢測的信號，實現定性定量的目標。高效液相色譜常用的檢測器有很多，按照用途分類有通用型和選擇型兩類，其中通用型的檢測器有示差折光、火焰離子化及電容等；而選擇性檢測器則有紫外吸收、紫外可見分光、熒光、化學發光、安培法、極譜法等。通用型檢測器主要針對任何有機物都存在的物理量（如折射指數、介電常數）進行監測，具有廣泛的適應性，但靈敏度相對較低。選擇性檢測大多針對被測物質的特異性響應進行檢測，不會受流動相或操作條件變化的影響。

按檢測性質分，檢測器可分為濃度型和質量型，前者與溶質在溶液中的濃度有關，是一種測定總體性質的檢測器，典型的有紫外吸收、示差折光和熒光等。后者則與待測物的質量有關，如氫火焰檢測器、庫倫檢測器都屬于質量型。

若按測量原理分，檢測器又可分為光學檢測器和電學檢測器。

1.紫外可見吸收檢測器

紫外可見吸收檢測器（ultraviolet-visible detector，UV-Vis）是HPLC中應用最廣泛的檢測器之一，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測器。其作用原理是基于被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關系遵守比爾定律。UV-Vis是最常用的檢測器，對大部分有機化合物有響應。

UV-Vis檢測器的特點如下：

a.靈敏度高，其最小檢測量10-9g/mL，故即使對紫外光吸收很弱的物質，也可以檢測；

b.線性范圍寬（比爾定律）；

c.流通池可做得很小（1mm×10mm，容積8μL）；

d.對流動相的流速和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫；

e.波長可選，易于操作，如，使用裝有流通池的可見紫外分光光度計（可變波長檢測器）。

缺點：對紫外光完全不吸收的試樣不能檢測；同時溶劑的選擇受到限制。

紫外可見檢測器的工作原理與結構同一般分光光度計相似，實際上就是裝有流動池的紫外可見光度計。UV-Vis檢測器可分為紫外吸收檢測器和二極管陣列檢測器兩種。

（1）紫外吸收檢測器　紫外吸收檢測器（圖1-11）常用氘燈作光源，氘燈則發射出紫外-可見區范圍的連續波長，并安裝一個光柵型單色器，其波長選擇范圍寬（190～800nm）。它有兩個流通池，一個作參比，一個作測量用。光源發出的紫外光照射到流通池上，若兩流通池都通過純的均勻溶劑，則它們在紫外波長下幾乎無吸收，光電管上接受到的輻射強度相等，無信號輸出。當組分進入測量池時，吸收一定的紫外光，使兩光電管接受到的輻射強度不等，這時有信號輸出，輸出信號大小與組分濃度有關。

UV-Vis檢測器的局限為流動相的選擇受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶劑不能作流動相。每種溶劑都有截止波長，當小于該截止波長的紫外光通過溶劑時，溶劑的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收檢測器的工作波長不能小于溶劑的截止波長。

（2）光電二極管陣列檢測器　光電二極管陣列檢測器（photodiode array detector，PDAD）也稱快速掃描紫外可見分光檢測器，是一種新型的光吸收式檢測器（圖1-12）。20世紀80年代中期，用一系列（1024個或512個）的光電二極管取代了傳統的光電倍增管，在一次色譜操作中可同時獲得多波長的吸光度，并且可以采用現代微機技術將各組分的保留時間、吸收波長和吸光度匯合到一起，繪制三維譜圖，提供既定量又定性的色譜信息。它采用光電二極管陣列作為檢測元件，構成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接收器上的全部波長的光信號，然后對二極管陣列快速掃描采集數據，得到吸光度（A）是保留時間（tR）和波長（l）函數的三維色譜光譜圖。由此可及時觀察與每一組分的色譜圖相應的光譜數據，從而迅速決定具有最佳選擇性和靈敏度的波長。

單光束二極管陣列檢測器，光源發出的光先通過檢測池，透射光由全息光柵色散成多色光，照射到陣列元件上，使所有波長的光在接收器上同時被檢測。陣列式接收器上的光信號用電子學的方法快速掃描提取出來，每幅圖像僅需要10ms，遠遠超過色譜流出峰的速度，因此可隨峰掃描。

傳統的紫外檢測器每次進樣只能完成單一波長掃描，而利用二極管陣列檢測器可以在一次程序運行中進行190～800nm之間的全波長立體掃描，并可在數據采集完成后顯示某一波長的色譜圖。因此，可以實現利用被測物質的光譜吸收曲線的模式圖形狀、最大吸收波長、色譜峰純度分析、導數光譜輔助定性及快速選擇最佳檢測波長等方面的優勢，從而彌補利用單一紫外波長吸收進行色譜分析過程中單獨采用色譜峰保留時間定性的不足，增強高效液相色譜定性分析能力。二極管陣列檢測器與紫外可見吸收檢測器的比較如表1-2所示，相比之下，PDAD在輔助定性上具有優勢，可以彌補UV-Vis的不足，而UV-Vis的靈敏度較高，信噪比更出色。

2.示差折光檢測器

示差折光檢測器（differential refractive Index detector，RID）是一種濃度型通用檢測器，對所有溶質都有響應，某些不能用選擇性檢測器檢測的組分，如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴等，可用示差檢測器檢測。示差檢測器是基于連續測定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來測定樣品含量的。光從一種介質進入另一種介質時，由于兩種物質的折射率不同，就會產生折射。只要樣品組分與流動相的折射率不同，就可被檢測，二者相差愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內檢測器的輸出與溶質濃度成正比。

檢測器的光路是由光源、凸鏡、檢測池、反射鏡、平板玻璃、雙光敏電阻等主要部件組成，檢測池有參比，測量兩個池室，它們對光路來說是串聯的。光源通過聚光鏡和夾縫在光柵前成像，并作為檢測池的入射光，出射光照在反射鏡上，光被反射，又入射到檢測池上，出射光在經過透射鏡照到雙光敏電阻上形成夾縫像。雙光敏電阻是測量電橋的兩個橋臂，當參比池和測量池流過相同的溶劑時，使照在雙光敏電阻的光量相同，此時橋路平衡，輸出為零。當測量池中流過被測樣品時，引起折射率變化，使照在雙光電阻上的光束發生偏轉，雙光敏電阻值發生變化，此時由電橋輸出訊號，即反映了樣品濃度的變化情況。在偏轉式示差折光檢測器中，光路在通過兩個裝有不同液體的檢測池時發生偏轉，偏轉的大小與兩種液體之間折射率的差異成比例。光路的偏轉由光敏元件上的位移測得，顯示了折射率的不同（圖1-13）。

在光學系統中采用多種精密裝置，提高了運行的穩定性，也使檢測器更加精致（圖1-14）。從鎢燈發出來的光束經過聚光透鏡、狹縫1、準直鏡和狹縫2，然后透過流通池，經零位玻璃調節器后在光敏元件上顯示影像。

當檢測池的樣品和參比的折射率發生變化時，光敏元件上的影像水平移動，如圖1-14所示，由光敏接收元件各自發出的電信號的變化與影像成比例。因此，可由兩信號輸出的差異獲得與折射率的差異相對應的信號。

RID的優點在于絕大多數物質的折射率與流動相都有差異，所以RID是一種通用的檢測方法。雖然其靈敏度與其他檢測方法相比要低1～3個數量級，但對于那些無紫外吸收的有機物（如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴）是比較適合的，所以其在凝膠色譜中是必備檢測器，在制備色譜中也經常使用。其缺點主要是靈敏度很低，并且不能用于梯度洗脫系統。

3.熒光檢測器

熒光檢測器（fluorescence detector，FD）屬于溶質型檢測器，是一種高靈敏度、有選擇性、可直接定量的檢測器。FD利用光致發光的原理進行檢測。研究表明，某些物質吸收了與它本身特征頻率相同的光線以后，原子中的電子從基態中的最低振動能級躍遷到較高的振動能級。電子在同類分子或其他分子中撞擊，消耗了相當的能量，從而下降到第一電子激發態中的最低振動能級，能量的這種轉移形式稱為無輻射躍遷。由最低振動能級下降到基態中的某些不同能級，同時發出比原來吸收的頻率低、波長長的一種光，就是熒光。被化合物吸收的光稱為激發光，產生的熒光稱為發射光。熒光的波長總要大于分子吸收的紫外光波長，通常在可見光范圍內。由于一個受激發的分子回到基態時可能以無輻射躍遷的形式產生能量損失，因而發射輻射的光子數通常都少于吸收輻射的光子數，以量子效率Q來表示。對可用熒光檢測的物質來說，Q值一般在0.1～0.9之間。對于稀溶液，熒光強度與熒光物質溶液濃度、摩爾吸光系數、吸收池厚度、入射光強度、熒光的量子效率及熒光的收集效率等成正相關。在其他因素保持不變的條件下，物質的熒光強度與該物質溶液濃度成正比，這是熒光檢測器的定量基礎。

熒光涉及光的吸收和發射兩個過程。任何能產生熒光的化合物，都需選擇合適的激發光波長λEx，以利于檢測。激發波長可通過熒光化合物的激發光譜來確定。激發光譜的具體檢測辦法是通過掃描激發單色器，使不同波長的入射光激發熒光化合物，產生的熒光通過固定波長的發射單色器，由光檢測元件檢測。最終得到熒光強度對激發波長的關系曲線，就是激發光譜。在激發光譜曲線的最大波長處，處于激發態的分子數目最多，即所吸收的光能量也最多，能產生最強的熒光。當考慮靈敏度時，測定應選擇最大激發波長。一般所說的熒光光譜，實際上僅指熒光發射光譜。它是在激發單色器波長固定時，發射單色器進行波長掃描所得的熒光強度隨熒光波長（即發射波長，λEm）變化的曲線。熒光光譜可供鑒別熒光物質，并作為熒光測定時選擇合適的測定波長的依據。另外，由于熒光測量儀器的特性，使光源的能量分布、單色器的透射率和檢測器的響應等性能會隨波長而變，所以同一化合物在不同的儀器上會得到不同的光譜圖，且彼此間無類比性，這種光譜稱為表觀光譜。要使同一化合物在不同的儀器上能得到具有相同特性的熒光光譜，則需要對儀器的上述特性進行校正。經過校正的光譜稱為真正的熒光光譜。

綜上所述，激發波長和發射波長是熒光檢測的必要參數。選擇合適的激發波長和發射波長，對檢測的靈敏度和選擇性都很重要，尤其是可以較大程度地提高檢測靈敏度。但是，熒光的性質與分子結構有密切關系，不同結構的分子被激發后，并不是都能發射熒光。某些不發熒光的物質可通過化學衍生化生成熒光衍生物，再進行熒光檢測。

與其他檢測器相比，FD的最小檢測濃度可達0.1ng/mL，適用于痕量分析；一般情況下FD的靈敏度比紫外檢測器約高2個數量級，但其線性范圍不如紫外檢測器寬。近年來，激光誘導熒光檢測器在痕量和超痕量分析中得到廣泛應用，其采用單色性和聚光性能好的激光被作為熒光檢測器的光源，利用激光作為相干光源具有較高的光子流量的特征極大地增強了熒光檢測的信噪比，因而具有很高的靈敏度。

4.電化學檢測器

電化學檢測器（electrochemical detector，ECD）是根據電化學原理和物質的電化學性質進行檢測的。在液相色譜中對那些沒有紫外吸收或不能發出熒光但具有電化學活性的物質，可采用電化學檢測法。若在分離柱后采用衍生技術，還可將它擴展到非電化學活性物質的檢測。早在1952年波蘭科學家Wiktor Kemula就將極譜技術用于液相色譜的檢測，但那時該技術發展緩慢。后來，對哺乳動物中樞神經系統代謝物的研究刺激了液相色譜電化學檢測器的現代發展。自從1974年第一臺商品化的液相色譜電化學檢測器出現后，一系列其他領域的應用逐漸發展。目前液相色譜電化學檢測器已在生化、醫學、食品、環境分析等領域獲得廣泛的應用。雖然按應用數量而言，電化學檢測器排在紫外吸收、熒光和示差折光檢測器之后占第四位，但是由于電化學檢測器的高選擇性、高靈敏度和低造價等優點，在液相色譜檢測中發揮著不可替代的作用。

電化學檢測器主要有安培、極譜、庫侖和電導檢測器四種。前三種統稱為伏安檢測器，以測量電解電流的大小為基礎，后者則以測量液體的電阻變化為依據。其中，以安培檢測器的應用最為廣泛。此外，屬于電化學檢測器的，還有依據測量流出物電容量變化的電容檢測器，依據測量電池電動勢大小的電位檢測器。另外，按照測量參數的不同，電化學檢測器又可分為兩類，即：測量溶液整體性質的檢測器，包括電導檢測器和電容檢測器；以及測量溶質組分性質的檢測器，包括安培、極譜、庫侖和電位檢測器。一般來說，前者通用性強，而后者具有較高的靈敏度和選擇性。目前，電化學檢測器已在各種無機和有機陰陽離子、生物組織和體液的代謝物、食品添加劑、環境污染物、生化制品、農藥及醫藥等的測定中獲得了廣泛的應用。其中，電導檢測器在離子色譜中應用最多。

電化學檢測器的優點如下：

① 靈敏度高，最小檢測量一般為ng級，有的可達pg級；

② 選擇性好，可測定大量非電化學活性物質中極痕量的電化學活性物質；

③ 線性范圍寬，一般為4～5個數量級；

④ 設備簡單，成本較低；

⑤ 易于自動操作。

5.化學發光檢測器

化學發光檢測器（chemiluminescence detector，CLD）是近年來發展起來的一種快速、靈敏的新型檢測器，因其設備簡單、價廉、線性范圍寬等優點。其原理是基于某些物質在常溫下進行化學反應，生成處于激發態勢反應中間體或反應產物，當它們從激發態返回基態時，就發射出光子。由于物質激發態的能量是來自化學反應，故叫作化學發光。當分離組分從色譜柱中洗脫出來后，立即與適當的化學發光試劑混合，引起化學反應，導致發光物質產生輻射，其光強度與該物質的濃度成正比。

這種檢測器不需要光源，也不需要復雜的光學系統，只要有恒流泵，將化學發光試劑以一定的流速泵入混合器中，使之與柱流出物迅速而又均勻地混合產生化學發光，通過光電倍增管將光信號變成電信號，就可進行檢測。這種檢測器的最小檢出量可達10～12g。CLD與其他檢測器相比，有以下優點：①因它背景光十分弱，是暗背景發光，所以靈敏度高；②它僅對被測組分有響應，其他組分無響應，所以選擇性好；③樣品可直接分析，使分析方法簡化，特別是可省去復雜、費時的樣品前處理。CLD的缺點是：①價格較高；②使用的反應氣或化學發光反應產物經常是危險性的氣體。

6.蒸發光散射檢測器

20世紀90年代出現的蒸發光散射檢測器（evaporative light-scattering detector，ELSD）是一種通用型檢測器，能檢測不含發色團的化合物，如：碳水化合物、脂類、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑、藥物（人參皂苷、黃芪甲苷），并在沒有標準品和化合物結構參數未知的情況下檢測未知化合物。

ELSD的原理為在粒子數量不變的條件下，光散射強度正比于由溶質濃度決定的粒子大小。ELSD檢測主要包括三個步驟：首先用惰性氣體將柱洗脫液霧化形成氣溶膠，然后在加熱的漂移管中將溶劑蒸發，最后余下的不揮發性溶質顆粒在光散射檢測池中得到檢測。

ELSD一般都是由三部分組成，即霧化器、加熱漂移管和光散射池。霧化器與分析柱出口直接相連，柱洗脫液進入霧化器針管，在針的末端，洗脫液和充入的氣體（通常為氮氣）混合形成均勻的微小液滴，可通過調節氣體和流動相的流速來調節霧化器產生的液滴大小。漂移管的作用在于使氣溶膠中的易揮發組分揮發，流動相中的不揮發成分經過漂移管進入光散射池。在光散池中，樣品顆粒散射光源發出的光經檢測器檢測產生光電信號。

影響蒸發光散射檢測器的因素有如下幾點：

（1）漂移管溫度的影響　隨溫度升高，流動相蒸發趨向完全，信噪比升高，但溫度過高可能導致組分部分化而使信號變小。最優溫度應是在流動相基本蒸發的基礎上，產生可接受噪聲的最低溫度。

（2）載氣流速對響應值的影響　隨氣體流速的增大，響應值隨之減小。因為一般漂移粒子的數目基本不變，大小由氣體流速決定，流速大，粒子小，散射光弱，響應值小。最優氣體流速應是在可接受噪聲的基礎上，產生最大響應的最低氣體流速。提高管溫和降低流速可使信噪比上升，但溫度過高或流速過低，噪聲增大的趨勢大于響應值增大的趨勢，致信噪比下降。

（3）鹽對基線噪聲的影響　對高濃度的鹽，鹽的不完全揮發會造成基線升高，使樣品響應值受氣體流速的影響相對變小；對低濃度的鹽，鹽較容易完全揮發使響應值受其影響較大。對用作緩沖體系的鹽既要容易揮發，又要具有好的純度，一般鹽的揮發性越大，所需的氣體流速和漂移管溫度越低。

與其他檢測器相比，ELSD的響應不依賴樣品的光學特性，任何揮發性低于流動相的樣品均能被檢測，不受其官能團的影響；作為通用型檢測器，ELSD的靈敏度比示差折光檢測器高，對溫度變化不敏感，基線穩定，適合與梯度洗脫液相色譜聯用。但是，ELSD不適合測定可揮發和半揮發性化合物，并且流動相必須是可揮發的，如果流動相含有緩沖液，則必須使用揮發性鹽如醋酸銨等，而且濃度要盡可能低。

（五）數據處理系統

該系統可對測試數據進行采集、存儲、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。隨著計算機的普及，HPLC的數據處理主要由計算機及相應的色譜工作站完成。

目前，不同HPLC儀器廠家均研發了各自不同的色譜工作站，雖然界面和操作相差極大，但主要的功能模式是類似的，大致包括狀態診斷、操作控制、數據譜圖處理等。

（1）狀態診斷　對HPLC的整體運行進行監控，并以模擬圖形的方式顯示診斷結果，協助使用者及時判斷儀器的故障并采取相應的措施。

（2）操作控制　所有參數的控制均由色譜工作站的圖形操作界面完成，使用者可以在工作站設定或更改諸如流動相流量、梯度洗脫程序、柱溫箱溫度、檢測器靈敏度、激發波長、吸收波長等參數，并具備大量樣品序列運行控制及序列完成后的自動關機操作等功能。

（3）數據譜圖處理　可對檢測結果作在線實時分析或離線統計處理?？梢郧逦@示色譜流出曲線，自動標注保留時間，按一定原則計算峰面積、峰高和半峰寬，集成有歸一化法、內標法和外標法等經典的統計數據處理模塊。而且可以按照應用的需要對譜圖進行放大、縮小、合并峰、疊加多重峰的操作，柱效、分離度、拖尾因子和工作曲線的計算均可在使用者的規范下自動完成。