第三節(jié)　植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用實(shí)例

一、植物的快繁與脫毒

1．紅肉蘋果

紅肉蘋果[Malus sieversiif.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf]為薔薇科蘋果屬小喬木，原產(chǎn)于中國(guó)新疆，春季長(zhǎng)出的新葉為紫紅色，果皮和果肉全為紅色。果肉中富含多種類黃酮，其中對(duì)抗癌起重要作用的槲皮素含量要比普通蘋果高。苗木繁殖效率低。

培養(yǎng)方法及步驟：

（1）外植體消毒及預(yù)培養(yǎng)　在春季芽萌動(dòng)前1周采集側(cè)芽飽滿的當(dāng)年生莖段，自來(lái)水沖洗1h，70%乙醇浸泡1min，10%次氯酸鈉（含吐溫）表面消毒15min，滅菌去離子水清洗莖段3次，切取帶飽滿芽的莖段（芽距離上下端各約1～2cm），芽向上斜插入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS＋0.1g/L 肌醇＋0.1mg/L IBA＋1mg/L 6-BA＋蔗糖＋0.8%瓊脂，pH 5.8），每個(gè)試管內(nèi)放置1個(gè)莖段。培養(yǎng)條件：4000～6000lx光照，16h/d，25℃室溫。

（2）葉盤法誘導(dǎo)不定芽　從預(yù)培養(yǎng)萌發(fā)的幼芽上選取頂端全展開的4片葉子，切成0.5～1cm2大小的葉盤，生理正面朝下放在培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)2周，然后光照培養(yǎng)，2周更換1次培養(yǎng)基（MS＋0.1g/L 肌醇＋0.2mg/L IBA＋1.0mg/L TDZ＋蔗糖＋0.8%瓊脂，pH 5.8）。再生率為100%，平均每個(gè)葉盤再生9.57個(gè)不定芽。

（3）材料擴(kuò)繁　選取高度2cm以上的不定芽，接種于擴(kuò)增培養(yǎng)基（MS＋0.1g/L 肌醇＋1mg/L IBA＋1mg/L 6-BA＋蔗糖＋0.8%瓊脂，pH 5.8），4周擴(kuò)繁率為8.27。

（4）生根培養(yǎng)　選取3cm以上，生長(zhǎng)健壯無(wú)根苗接種到生根培養(yǎng)基（MS＋0.1g/L 肌醇＋0.6mg/L IBA3%＋蔗糖＋0.8%瓊脂，pH 5.8）。在弱光條件（1000～5000lx）下培養(yǎng)，4周時(shí)生根率為93.3%。

2．鐵皮石斛

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Mi-go），為蘭科石斛屬多年生草本植物，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等諸多功效。鐵皮石斛對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，自然條件下繁殖率極低，種子不易萌發(fā)，生長(zhǎng)緩慢，市場(chǎng)供不應(yīng)求。由于過度采挖及生境惡化，鐵皮石斛野生資源日趨稀少。

（1）種子快繁技術(shù)

① 外植體消毒及預(yù)培養(yǎng)　挑選飽滿、未開裂的蒴果，流水沖洗15min，雙蒸水沖洗3～5次。在超凈工作臺(tái)上將蒴果用75%乙醇沖洗3次，酒精棉球擦拭果實(shí)表面，無(wú)菌水沖洗2～3次，0.1%升汞浸泡2～5min，無(wú)菌水漂洗5次，于酒精燈上灼燒數(shù)秒后用滅菌解剖刀切開口。

② 種子萌發(fā)培養(yǎng)　將種子接種于培養(yǎng)基1/2MS上，暗處培養(yǎng)3d，再轉(zhuǎn)入光下進(jìn)行培養(yǎng)，30d后種子平均萌發(fā)率為90%。

③ 原球莖增殖培養(yǎng)　選取直徑大小在0.5～1.0cm，顏色淡綠色、沒有玻璃化的團(tuán)狀原球莖，接種到原球莖增殖培養(yǎng)基（MS＋0.2mg/L NAA＋0.5mg/L 6-BA），35d增殖率為120%。

④ 芽增殖培養(yǎng)　將原球莖接入芽增殖培養(yǎng)基（MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.25mg/L NAA＋20%馬鈴薯提取液），植株健壯，葉片呈深綠色，且生出了根，35d時(shí)其再生率高。

⑤ 生根培養(yǎng)　將叢生芽接種到生根培養(yǎng)基（MS＋0.2mg/L NAA＋20%馬鈴薯提取液），35d平均根長(zhǎng)1.9cm。

所有培養(yǎng)基的pH6.0左右，培養(yǎng)條件為溫度（25 ± 2）℃、光照強(qiáng)度 1500～2000lx、濕度 60%～75%、光照12h/d。

（2）莖段快繁技術(shù)

① 外植體消毒及初代培養(yǎng)　在無(wú)菌條件下將沖洗干凈的莖段用75%乙醇消毒20s后，無(wú)菌水沖洗1次，0.1%升汞滅菌10min，無(wú)菌水沖洗3～5次，切成帶1個(gè)節(jié)的1cm莖段。

② 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)　消毒過的小莖段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋1.5-2.0mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA＋10%椰子汁），腋芽萌動(dòng)早，生長(zhǎng)快，40d時(shí)誘導(dǎo)叢生芽多，50d時(shí)叢生芽高0.5～1.5cm。轉(zhuǎn)接2～3次，不同鐵皮石斛生理小種叢生芽誘導(dǎo)率在7.8%～30.8%之間。

③ 繼代增殖培養(yǎng)　將分化的叢生芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA＋10%椰子汁）。40d時(shí)不同鐵皮石斛生理小種增殖倍數(shù)在3～5之間，芽生長(zhǎng)正常。

④ 壯苗生根培養(yǎng)　將高1.0～3.0cm叢生芽接種到生根培養(yǎng)基（1/2MS＋0.5mg/L NAA＋0.2mg/L IBA＋10%香蕉泥），生根率在95%以上，根個(gè)數(shù)在4.2～5.2個(gè)之間。

⑤ 煉苗移栽　鐵皮石斛生根瓶苗或袋苗在自然光下煉苗2個(gè)月，移栽于松樹皮上，2個(gè)月后成活率在90%以上。

所有培養(yǎng)基均附加30.0g/L蔗糖、瓊脂4.0g/L，pH5.8。培養(yǎng)條件：溫度25～28℃，光照強(qiáng)度 1500～2000lx，光照9h/d。

3．草莓

草莓（Fragaria ananassa Ducde）是薔薇科草莓屬宿根性多年生常綠草本植物。草莓成熟果實(shí)鮮紅艷麗，柔軟多汁，香味濃郁，酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎。草莓在我國(guó)多數(shù)地區(qū)廣泛栽培。有些栽培品種品質(zhì)差、產(chǎn)量低，在種植老區(qū)出現(xiàn)病害日趨嚴(yán)重，尤其是病毒的侵染，導(dǎo)致植株長(zhǎng)勢(shì)差、產(chǎn)量低、品質(zhì)劣。

方法一：莖尖脫毒培養(yǎng)

（1）外植體消毒及莖尖培養(yǎng)　先將草莓“豐香”匍匐莖放在40℃熱水中處理4h，選取匍匐莖頂端約3～4cm長(zhǎng)的頂芽，自來(lái)水沖洗2～3h，在超凈臺(tái)上摘除匍匐莖外部大葉，用70%酒精浸泡30s，飽和漂白精浸泡15min，然后用無(wú)菌水沖洗3～5遍。在雙筒解剖鏡下由外向內(nèi)逐層剝?nèi)ビ兹~，直至閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來(lái)，切取0.5mm左右大小莖尖接種于培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA）。莖尖成活率47.37%，脫毒效果良好。

（2）快速繁殖　將分化的組培苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA），增殖培養(yǎng)過程中40d或更長(zhǎng)時(shí)間繼代1次，其增殖系數(shù)為6。

① 試管苗生根　經(jīng)過幾代增殖培養(yǎng)后，將生長(zhǎng)健壯的組培苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20d左右，生根率達(dá)100%，平均生根6條/株，根長(zhǎng)4～5cm。

② 試管苗馴化　生根培養(yǎng)20d后，將生根試管苗瓶口打開，培養(yǎng)室內(nèi)放置2～3d，取出后洗凈其根部的培養(yǎng)基（1/2MS），生根苗移栽到全蛭石的基質(zhì)上馴化，成活率高于98%。

培養(yǎng)基均含有3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH5.6。光照強(qiáng)度31.25μmol/（m2·s），溫度（25±2）℃。　

方法二：葉片培養(yǎng)

（1）外植體消毒及預(yù)處理　從田間取草莓“鬼露甘”15～20d在左右葉齡的葉片，用自來(lái)水沖洗30～60min，75%酒精中浸泡40s，無(wú)菌水沖洗3～5次，0.1%升汞溶液中輕搖4min，用無(wú)菌水沖洗3～5次，用無(wú)菌濾紙吸干水分。

（2）不定芽誘導(dǎo)　葉片進(jìn)行四周刻傷，其遠(yuǎn)軸端接觸不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.1mg/L IBA），先進(jìn)行7d的暗培養(yǎng)，防止外植體的褐化。葉齡在15～20d時(shí)，葉片再生能力最強(qiáng)，葉片再生頻率最高，可達(dá)60%以上。當(dāng)葉齡超過40d，再生率低于10%。

（3）不定芽伸長(zhǎng)　將再生的不定芽從基部切下，轉(zhuǎn)移到不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.5mg/L IBA）。一般單生芽都能伸長(zhǎng)直至成苗，分不開的叢生芽會(huì)有1～2個(gè)健壯的小芽經(jīng)伸長(zhǎng)培養(yǎng)后能夠發(fā)育成植株，其他的發(fā)育不良或枯萎死亡。

（4）不定芽生根　待不定芽長(zhǎng)到3cm左右，從莖基部分切下接種到生根培養(yǎng)基（MS＋0.2mg/L IBA），誘導(dǎo)無(wú)菌苗發(fā)根，獲得完整植株，生根率達(dá)100%，試管苗移栽成活率87%。

上述培養(yǎng)基均含有3%蔗糖、6g/L瓊脂，pH5.8。121℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度1500～2000lx，光/暗周期16h/8h，溫度（25±2）℃。

4．馬鈴薯

馬鈴薯（Solanum tuberousm L．）是雙子葉植物，屬茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）一年生草本植物。馬鈴薯生育期短，產(chǎn)量高，營(yíng)養(yǎng)豐富，是典型的糧菜兩用型作物，是世界重要栽培作物之一，主要分布在歐洲和亞洲。我國(guó)是世界上最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)。馬鈴薯在種植過程中感染病毒而引起退化，直接影響了馬鈴薯的品質(zhì)及產(chǎn)量，嚴(yán)重阻礙了馬鈴薯的生產(chǎn)和利用。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)方法特別是莖尖組織培養(yǎng)來(lái)獲取脫毒苗，已成為當(dāng)前解決馬鈴薯品種退化的主要技術(shù)。

方法一：莖尖脫毒培養(yǎng)

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體預(yù)處理及莖尖培養(yǎng)　馬鈴薯品種隴薯6號(hào)塊莖出芽后，將芽用自來(lái)水沖洗2h，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸30s，0.1%升汞浸泡8～10min，然后無(wú)菌水沖洗3～4遍，接種到快繁培養(yǎng)基上。待成苗后在40×解剖鏡下剝?nèi)蓚€(gè)葉原基的莖尖，接種到快繁培養(yǎng)基（MS＋0.5g/L 6-BA＋0.1mg/L GA3＋0.1mg/L NAA＋0.05%活性炭）中，成活率可達(dá)80%，成苗率70%，經(jīng)檢測(cè)可獲得11.17%的去毒株。

（2）切繁培養(yǎng)　待單芽分化出兩片可見葉、莖明顯伸長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)入無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，苗高4～5cm時(shí)開始切繁。

以上培養(yǎng)基均加3%白糖和0.65%卡拉膠，培養(yǎng)室通過自然光培養(yǎng)。

方法二：花藥培養(yǎng)

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）材料處理及花藥愈傷組織誘導(dǎo)　選取小孢子發(fā)育在單核靠邊期至雙核早期的花蕾，花蕾經(jīng)低溫（4℃）處理24～48h，用0.1% HgCl2消毒10min，無(wú)菌水沖洗4～5次，在無(wú)菌條件下取出花藥接種在花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L NAA＋0.5mg/L 2，4-D＋0.5mg/L KT），黑暗培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)在相同的培養(yǎng)條件下不同基因型材料的愈傷組織的誘導(dǎo)頻率有較大的差異。蔗糖濃度提高到6%時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

（2）愈傷組織的分化　30d后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS＋0.2mg/L NAA＋2.0mg/L 6-BA＋1.0mg/L ZT），每隔20d繼代1次。分化培養(yǎng)條件：16h/d，光照強(qiáng)度 2000lx，培養(yǎng)溫度25℃。在分化了根的愈傷組織中能分化出綠苗，煉苗移栽后的雙單倍體植株生長(zhǎng)勢(shì)、葉色、薯型等性狀與對(duì)照相比存在差異。

5．香蕉

香蕉屬于芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa），是世界著名的熱帶、亞熱帶水果，其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，依照其用途通常將香蕉作物分為香蕉（banana）和糧蕉。目前栽培的香蕉品種主要是三倍體，遺傳背景復(fù)雜，高度不育和單性結(jié)實(shí)，因此無(wú)性繁殖是香蕉的主要繁殖方式。

（1）外植體消毒及腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)　“金手指”（Goldenfinger）香蕉，選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病害植株40～50cm高的吸芽為外植體，用自來(lái)水沖洗，切除上部的外假莖，留下6cm高的莖和下部外假莖。在無(wú)菌條件下逐層剝?nèi)グ谇o外的葉鞘，直至外植體大小為2cm×2cm×2cm，70%酒精浸泡15s，0.1%升汞溶液消毒2次，每次5min，無(wú)菌水沖洗4～5次，將處理后的外植體縱切一分為二接種到腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)基（MS＋6 BA 6.0mg/L＋I(xiàn)BA 0.5mg/L）中培養(yǎng)。25d左右莖節(jié)處有不定芽生成，不定芽數(shù)量平均可達(dá)3.5個(gè)。

（2）叢生芽增殖培養(yǎng)　將腋芽切下在叢生芽增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)。叢生芽增殖培養(yǎng)初期采用增殖培養(yǎng)基1（MS＋6 BA 6.0mg/L＋I(xiàn)BA 0.5mg/L）；多次增殖培養(yǎng)后應(yīng)采用增殖培養(yǎng)基2（MS＋6-BA 4.0mg/L＋I(xiàn)BA 0.2mg/L）；5次增殖培養(yǎng)后，增殖速度可以達(dá)到2.5～3.0倍。

（3）壯苗生根培養(yǎng)　繼代到10～12代時(shí)進(jìn)行壯苗和生根培養(yǎng)。將2～3cm長(zhǎng)的生長(zhǎng)正常的叢生芽切成單芽后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS＋I(xiàn)BA 1.0mg/L＋NAA 0.2mg/L），培養(yǎng)7d左右100%生根，生長(zhǎng)快。

（4）煉苗和移栽　當(dāng)根系長(zhǎng)出后進(jìn)行煉苗培養(yǎng)，30d左右出瓶移栽，成活率可達(dá)95%以上，移栽后需注意澆水。

以上培養(yǎng)基均含蔗糖 30g/L、瓊脂6.7g/L，pH5.5～5.8。培養(yǎng)溫度（28±2）℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時(shí)間12h/d。

6．白芨

白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]為蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla）多年生草本植物，花艷麗，地下莖肥厚，是常用的中藥材。目前，白芨的采集主要以野生自然資源為主，隨著白芨的價(jià)值日漸提升，野生資源不能滿足市場(chǎng)需求。白芨蒴果內(nèi)含種子數(shù)萬(wàn)粒，但在自然條件下不易發(fā)芽，其繁殖方式是以分株繁殖為主，但繁殖系數(shù)較低，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要，而且分株繁殖方法，發(fā)生病毒很難去除。

（1）外植體消毒及種子萌發(fā)培養(yǎng)　選取4個(gè)月的果莢，用75%乙醇浸泡3min后，置于10%次氯酸鈉溶液中消毒20min，再用無(wú)菌水沖洗4～5次后，十字狀切開果實(shí)。用接種針或鑷子在解剖鏡下將白色粉末狀胚接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基（1/2MS＋10%椰子汁），并轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)成苗。萌發(fā)率可達(dá)93%，成苗率95%。

（2）叢生芽誘導(dǎo)　將試管苗的莖尖切下接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋0.5g/L 6-BA＋0.2mg/L NNA）可誘導(dǎo)叢生芽的發(fā)生。

（3）生根誘導(dǎo)　將叢生芽分離為分生苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基（MS＋0.5g/L NAA＋10% 香蕉汁），轉(zhuǎn)瓶后30～40d均能形成根。在此培養(yǎng)基中加入10%香蕉汁能促進(jìn)小苗生根并有壯苗作用。

（4）試管苗移栽　將有根試管苗在室溫下煉苗3～5d，再打開瓶塞煉苗2～3d，洗去培養(yǎng)基，晾干后移植于透水良好的碎磚、蕨根、碎炭、粗椰糠混合基質(zhì)中，置于陰涼處，保持較高的空氣濕度和適當(dāng)通風(fēng)，成活率均可達(dá)90%以上。試管苗在種植3～4年后可作為藥材收購(gòu)。

所有培養(yǎng)基用0.7%瓊脂固化，pH5.5～5.8、培養(yǎng)溫度（25±2）℃，每日光照10～12h，光照強(qiáng)度1600～2000lx。

7．藍(lán)莓

藍(lán)莓（Vaccinium spp.）是杜鵑花科（Ericaceae）越橘亞科（Vaccinioideae）越橘屬小漿果灌木?；ㄇ嗨睾扛?，具有低糖、低脂肪和強(qiáng)抗氧化性的特點(diǎn)，是延緩人體機(jī)能衰退的天然功能性水果。扦插繁殖受到季節(jié)的限制，并且生根緩慢，生根率不高，繁殖速度慢。培養(yǎng)方法及步驟：

（1）外植體消毒及預(yù)處理　剪取藍(lán)莓“頂峰”健壯優(yōu)株萌發(fā)的新枝條作為外植體。去除枝條上的葉片，保留腋芽，將枝條剪切成長(zhǎng)約2cm的莖段，用自來(lái)水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇浸泡30s，再用0.1% HgCl2浸泡2～3min，無(wú)菌水沖洗5～6次，無(wú)菌濾紙吸干水分。

（2）腋芽的誘導(dǎo)　將消毒處理過的莖段接種于腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（WPM＋0.5mg/L ZT），1個(gè)月時(shí)芽誘導(dǎo)率80%。

（3）繼代培養(yǎng)　將以上培養(yǎng)獲得的無(wú)菌植株切成約2cm的莖段，接種于繼代培養(yǎng)基（WPM＋ 1.0mg/L ZT）。30d時(shí)平均株高6.6cm，增殖系數(shù)13.5。

（4）生根培養(yǎng)　取高約3～5cm的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，2個(gè)月培養(yǎng)誘導(dǎo)出不定根系，試管苗生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠。

（5）試管苗的移栽　當(dāng)試管苗長(zhǎng)到4～7cm時(shí)即可出瓶移栽，將瓶蓋打開，煉苗3d后取出試管苗，用清水沖洗根部培養(yǎng)基，栽入泥炭土中，澆透水，環(huán)境溫度22～25℃，濕度80%～90%，60d后移栽成活率80%。

以上培養(yǎng)基均加3%的蔗糖和0.6%的瓊脂（生根培養(yǎng)基中用河沙代替瓊脂），pH 5.2。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時(shí)間12h/d。

8．百合

百合（Lilium spp.）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本球根植物的統(tǒng)稱，種類豐富。全世界百合屬植物100多種，其中中國(guó)產(chǎn)55種。百合用途廣泛，既是名花，又為良藥，很多還可以食用。百合的珠芽繁殖、小子球繁殖和鱗片繁殖的系數(shù)較低，長(zhǎng)期的無(wú)性營(yíng)養(yǎng)繁殖易感染病毒。

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒　取綠花百合健康植株的地下鱗莖作為外植體，洗去污物，5%洗衣粉溶液漂洗10min，再用清水沖洗干凈，然后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌。先用75%乙醇浸泡10s，再轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中浸泡10min，無(wú)菌水沖洗6～8次，每次不低于2min，備用。

（2）胚性愈傷組織和小鱗莖的誘導(dǎo)　將消毒好的鱗片切成約0.8cm×0.8cm方塊接種于胚性愈傷組織和小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋6-BA 0.5mg/L＋NAA 0.5mg/L＋2，4-D 0.1mg/L），培養(yǎng)35d后出愈率達(dá)89.29%，小鱗莖發(fā)生系數(shù)4.7。

（3）增殖培養(yǎng)　將胚性愈傷組織切成小塊，接種于增殖培養(yǎng)基（MS＋6-BA 1.0mg/L＋2，4-D 0.1mg/L），培養(yǎng)35d后繁殖倍數(shù)5.0。

（4）生根培養(yǎng)　選取生長(zhǎng)健壯高3～4cm的小植株接入生根培養(yǎng)基（1/2MS＋NAA 0.2mg/L）中，培養(yǎng)35d后生根率為100%，且根系粗壯多根毛，幼苗移栽成活率達(dá)90%以上

以上培養(yǎng)基均加3%蔗糖和0.45%瓊脂，pH 5.8～6.0。培養(yǎng)室溫度控制在（20±1）℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時(shí)間12h/d。

9．紅掌

紅掌（Anthurium andraeanum）別稱花燭、安祖花，是天南星科花燭屬多年生常綠草本植物，在世界各地廣泛栽培。紅掌主要用于切花和盆栽，具有極高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。紅掌常規(guī)采用種子繁殖和分株繁殖，繁殖率低，難以滿足市場(chǎng)需求。

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒及預(yù)培養(yǎng)　將紅掌品種“紅國(guó)王”幼嫩葉片、葉柄放在盛有洗潔精溶液的燒杯中搖10min，用自來(lái)水沖洗5～6次，除去洗潔精液和表面污物；接著在無(wú)菌條件下，用75%乙醇消毒30s；再用0.1% HgCl2消毒5～8min，倒去HgCl2溶液，用無(wú)菌水沖洗5～6次。

（2）愈傷組織誘導(dǎo)　將消毒后的葉片切成1cm×1cm小塊，葉柄切成長(zhǎng)約1cm的莖段，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基[MS（1/2NH4NO3）＋6-BA 1.0mg/L＋2，4-D 0.4mg/L]。光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1000～1500lx，培養(yǎng)30d，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率86.21%，莖段愈傷組織誘導(dǎo)率為76.67%。

（3）誘導(dǎo)芽分化　將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種至芽分化培養(yǎng)基[MS（1/2NH4NO3）＋6-BA 1.0mg/L＋KT.5mg/L＋CH 100mg/L]上進(jìn)行培養(yǎng)，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1000～2000lx；光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度1500～3000lx，不定芽分化率高85%。

（4）芽增殖培養(yǎng)　將誘導(dǎo)獲得的無(wú)菌芽切下轉(zhuǎn)至芽增殖培養(yǎng)基（MS＋6-BA 0.2～0.8mg/L），增殖系數(shù)在3.5以上。

（5）生根培養(yǎng)　將高2cm以上芽由叢生芽上單個(gè)切下，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基（1/2MS＋NAA 0.5mg/L），生根光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度2000～3000lx。30d生根率達(dá)到93.05%，平均出根數(shù)為4～6條。

（6）移栽　將高約4cm、根系發(fā)達(dá)的健壯幼苗移栽至裝有消毒基質(zhì)的穴盤中，pH調(diào)至5.8左右，30d移栽成活率95%以上。

以上培養(yǎng)基均加3%蔗糖和0.7%瓊脂，pH 5.8。培養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃。

10．礬根

礬根（Heuchera micrantha）又稱為珊瑚鈴，虎耳草科（Saxifragaceae）礬根屬多年生耐寒草本花卉，原產(chǎn)于美洲中部。由于其具有彩葉、耐寒、耐陰的優(yōu)良品質(zhì)，是北方地區(qū)布置陰生環(huán)境的優(yōu)良宿根花卉。品種繁多，部分品種可以播種繁殖，有些品種采用無(wú)性繁殖。

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒　將礬根品種Obsidian截成1.0～1.5cm的帶頂芽或腋芽的莖段，用洗衣粉仔細(xì)清洗，并在流水下沖洗1h，用無(wú)菌水沖洗2次，75%乙醇洗滌30s，無(wú)菌水沖洗2次，2%次氯酸鈉溶液浸泡12min，最后用無(wú)菌水沖洗5次，濾紙吸取外植體表面水分，備用。

（2）誘導(dǎo)培養(yǎng)　滅菌的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋3mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA），14d左右出芽，生長(zhǎng)速度快，發(fā)育正常，誘導(dǎo)率達(dá)92%。

（3）增殖培養(yǎng)基　將誘導(dǎo)的芽接種于增殖培養(yǎng)基（MS＋1mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA），30d生長(zhǎng)的莖段伸長(zhǎng)可達(dá)2.55倍，增殖系數(shù)達(dá)8.6倍，不定芽生長(zhǎng)和分化速度較快，發(fā)育正常，莖段粗壯。

（4）生根和煉苗　在1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d，生根率100%，根色潔白，主根堅(jiān)韌，須根多，根長(zhǎng)可達(dá)2～5cm。經(jīng)煉苗移栽2個(gè)月，主根明顯增粗，須根數(shù)略增長(zhǎng)，成活率90%以上。

以上培養(yǎng)基均加3%蔗糖和0.8%瓊脂，pH 5.8。培養(yǎng)條件：（23±1）℃，光照14h/d，光照強(qiáng)度4000lx。

11．歐洲甜櫻桃

歐洲甜櫻桃（Cerasus avium）為薔薇科（Rosaceae）李亞科櫻屬植物，原產(chǎn)歐洲黑海沿岸及西亞地區(qū)。有“春果第一枝”的美稱。其果實(shí)成熟早，色澤艷麗，營(yíng)養(yǎng)豐富，外觀和內(nèi)在品質(zhì)俱佳，具有便于加工、適宜生食、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)。

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒　每年6～7月間剪取歐洲甜櫻桃“紅燈”植株的幼嫩枝條，剪去葉片后用流水沖洗5～6h，用皂液刷凈表面，剝?nèi)ロ斞亢鸵秆客獠康镊[片，露出2～5mm大小的芽尖；切取莖尖、腋芽或帶腋芽的莖段，將其置于含有40mg/L維生素C的無(wú)菌水中浸泡數(shù)分鐘，再用70%乙醇表面滅菌1min、0.1% HgCl2溶液振蕩浸泡10min，無(wú)菌水沖洗5次，備用。

（2）初代培養(yǎng)　芽體在初代培養(yǎng)基（MS＋0.8g/L 6-BA＋0.02mg/L NAA＋0.5mg/L AC）上培養(yǎng)約10d開始萌動(dòng)，迅速展葉，長(zhǎng)勢(shì)良好，萌發(fā)率可高達(dá)90%。

（3）繼代培養(yǎng)　剪取高約2cm的無(wú)菌苗，轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基（MS＋0.6g/L 6-BA＋0.02mg/L NAA＋0.1mg/L GA3＋40mg/L VC），培養(yǎng)25d，組培苗繼代增殖系數(shù)3.0左右，成苗率92.5%?！?/p>

（4）生根培養(yǎng)　選取在繼代培養(yǎng)基上高3～4cm、長(zhǎng)勢(shì)良好的無(wú)菌苗，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基（1/2MS＋0.8mg/L NAA）上培養(yǎng)，20d生根率達(dá)到100%，根個(gè)數(shù)為3～4條，根系健壯，葉片充分舒展。移栽成活率86.7%。

以上培養(yǎng)基均加0.7%的瓊脂，pH 5.8，初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)添加蔗糖3%，生根培養(yǎng)添加蔗糖1.5%。培養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度80μmol/（m2·s），光照時(shí)間15h/d。

12．蝴蝶蘭

蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）為熱帶蘭中的珍品，被譽(yù)為“洋蘭皇后”。蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，植株極少發(fā)育側(cè)枝，且種子極難萌發(fā)，實(shí)生苗變異嚴(yán)重。

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒　取蝴蝶蘭“V31”帶有腋芽的花梗，沖洗干凈，腋芽?jī)啥烁鞅Ａ?.5～0.8cm，用70%乙醇處理25s、0.2% HgCl2處理11 min。將滅菌后的花梗腋芽的包葉除去，芽下端斜切，芽上端平切，備用。

（2）叢生芽誘導(dǎo)　將處理好的外植體插入培養(yǎng)基（MS＋8.0g/L 6-BA＋2.0mg/L NAA＋15g/L椰子粉）中，芽點(diǎn)距離培養(yǎng)基約0.5cm。培養(yǎng)50d，平均出芽數(shù)2.60，平均分化時(shí)間6.2d，分化率84.57%。

（3）增殖培養(yǎng)　當(dāng)無(wú)菌苗長(zhǎng)至2.0cm左右，取大小一致的無(wú)菌芽苗，接入增殖培養(yǎng)基（MS＋10g/L 6-BA＋0.6mg/L NAA＋0.2mg/L 2，4-D＋15g/L椰子粉），培養(yǎng)60d，平均增殖倍數(shù)7.94。

（4）生根培養(yǎng)　芽增殖培養(yǎng)基（1/2MS＋1.0g/L 6-BA＋0.1mg/L NAA＋20g/L 蔗糖＋10g/L 香蕉粉）中培養(yǎng)30d左右，選取健壯的組培苗接入生根培養(yǎng)基。培養(yǎng)45d，生根率達(dá)到100%，平均生根時(shí)間11.77d，平均生根數(shù)9.47個(gè)。

以上培養(yǎng)基均加0.8%瓊脂，pH 5.7，叢生芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)添加3%蔗糖，生根培養(yǎng)添加2%蔗糖。培養(yǎng)條件：溫度（26±2）℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度27～36μmol/（m2·s）。

13．金線蘭

金線蘭（Anoectochilus roxburghii）為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，又名金線蓮?？扇萑胨?，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材。金線蘭的種子小，種胚發(fā)育不全，在野生自然條件下萌發(fā)率和繁殖率都極低，難以大量繁殖。

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒　選取生長(zhǎng)健壯金線蘭莖尖和莖段，沖洗干凈，置于加入少量洗滌劑的溶液中，用軟毛刷輕輕刷洗，再用流水沖洗1h左右。用75%乙醇消毒30s，轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2中消毒8min，用無(wú)菌水漂洗5次，吸干水分備用。

（2）叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)　將金線蘭莖尖和帶節(jié)莖段切成1cm，接種于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋1mg/L 6-BA＋1mg/L NAA）。莖尖和帶節(jié)莖段均能誘導(dǎo)出叢生芽，但帶節(jié)莖段叢生芽誘導(dǎo)率高于莖尖，且?guī)Ч?jié)莖段最多可產(chǎn)生6～8個(gè)新芽。

（3）繼代培養(yǎng)　選取生長(zhǎng)健壯的叢生芽，將其切分為2～3株一叢，接種于培養(yǎng)基（MS＋1mg/L IBA＋3mg/L 6-BA）中進(jìn)行叢生芽增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)5.2。

（4）生根培養(yǎng)　當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至3～5cm時(shí)，將其切為單株小苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基（1/2MS＋0.5mg/L IBA＋0.5mg/L NAA）。生根率84.6%，平均根數(shù)2.45。健壯植株移栽60d統(tǒng)計(jì)成活率為90%。

以上培養(yǎng)基均加3%蔗糖和0.62%瓊脂，pH 5.8。培養(yǎng)條件：（25±2）℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/d。

14．多肉植物

多肉植物也稱為多漿植物、肉質(zhì)植物，在園藝上有時(shí)稱多肉花卉。多肉植物是指植物營(yíng)養(yǎng)器官的某一部分，如莖或葉或根（少數(shù)種類兼有兩部分）具有發(fā)達(dá)的薄壁組織用以儲(chǔ)藏水分，且在外形上顯得肥厚多汁的一類植物。多肉植物品種現(xiàn)已達(dá)12000多種，隸屬80多科，近800屬。目前，多肉植物育性較差，大多采用扦插、嫁接和分株等繁殖方法，繁殖系數(shù)較低，且繁殖周期長(zhǎng)，難以滿足生產(chǎn)需要。利用植物組培技術(shù)，可以發(fā)揮多肉植物的快速繁殖、豐富品種的作用。下面以多肉植物“勞爾”為例，其培養(yǎng)方法及步驟見下：

（1）外植體消毒　選取多肉植物勞爾（Sedum clavatum L．）的葉片，先用自來(lái)水沖洗5min，然后在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇消毒30s，再用0.1% HgCl2消毒7min，最后用無(wú)菌蒸餾水沖洗3～5次，用無(wú)菌濾紙吸干多余水分，備用。

（2）愈傷組織誘導(dǎo)　將消毒好的葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋3mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA＋1mg/L KT）。培養(yǎng)60d，愈傷組織誘導(dǎo)率95.7%，葉片膨脹形成球狀愈傷組織，增殖速度較快，愈傷組織呈深綠色。

（3）不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)　將愈傷組織接種至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（3/4MS＋3mg/L 6-BA＋0.3mg/L NAA），培養(yǎng)45d，不定芽分化率80.0%，每個(gè)愈傷組織塊可形成多個(gè)芽，且新芽健壯，生長(zhǎng)旺盛。

（4）生根培養(yǎng)　將分化出的新芽切下，接種至生根培養(yǎng)基（1/2MS＋0.03mg/L NAA），30d時(shí)生根率94.89%，根多且粗長(zhǎng)。經(jīng)煉苗后移栽，基質(zhì)采用珍珠巖∶蛭石（1∶2），成活率為90%。

以上培養(yǎng)基均加3%蔗糖和0.9%瓊脂，pH 6.2～6.4。培養(yǎng)條件：24～26℃，8h/d，光照強(qiáng)度18μmol/（m2·s）。

15．風(fēng)鈴玉

風(fēng)鈴玉（Ophthalmophyllum friedrichiae），番杏科風(fēng)鈴玉屬多肉植物。風(fēng)鈴玉植株小巧玲瓏，花朵潔白素雅，是小型多肉植物中的珍品，但栽培較為困難。

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒　選取風(fēng)鈴玉葉片，在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗1次，再用0.1% HgCl2消毒10min，無(wú)菌水沖洗5次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，備用。

（2）愈傷組織誘導(dǎo)　將消毒好的葉片切割成1.0cm×0.5cm大小的片狀，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋0.2mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA），愈傷組織誘導(dǎo)率85.7%，愈傷組織呈現(xiàn)淡黃色顆粒狀，質(zhì)地松散。

（3）不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)　將生長(zhǎng)旺盛的葉片愈傷組織切成約4mm×4mm大小的塊狀，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋0.2mg/L 6-BA＋0.02mg/L IBA）。培養(yǎng)30d，每塊愈傷組織有11個(gè)不定芽，平均芽高1.1cm。

（4）生根培養(yǎng)　選擇生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的無(wú)菌苗，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基（1/2MS＋0.1mg/L IBA）。21d時(shí)生根率83.3%，平均生根數(shù)2.7條。

以上培養(yǎng)基均加0.7%瓊脂，pH 5.8，愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽誘導(dǎo)添加3%蔗糖，生根培養(yǎng)添加2%蔗糖。培養(yǎng)條件：（25±2）℃，14h/d，光照強(qiáng)度18μmol/（m2·s）。

16．非洲菊

非洲菊（Gerbera jamesonii）是異花授粉植物，自交不親和，自然條件下種子萌發(fā)力低，且種子繁殖后代性狀容易發(fā)生變異，失去原有種性，如花型變小、花梗變細(xì)等。非洲菊傳統(tǒng)采用種子繁殖、分株繁殖和扦插繁殖等。對(duì)具有優(yōu)良品種特性的非洲菊采用植物組織培養(yǎng)法進(jìn)行快速繁殖，能夠在短期內(nèi)生產(chǎn)出整齊均勻的大量健壯種苗。

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒　取非洲菊帶3cm花梗的未展開花蕾，用洗滌劑溶液浸泡10min，在流水下沖洗干凈。在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇浸泡30s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡8min，無(wú)菌水沖洗3～5次，備用。

（2）愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)　將消毒好的花蕾用解剖刀縱向切開，挑出花托，并對(duì)切成1/4片花托，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋6mg/L 6-BA＋0.3mg/L IAA）上。外植體接種后3～4d切口膨大，6～7d后長(zhǎng)出愈傷組織，愈傷組織呈現(xiàn)青綠色，并伴隨一定程度的褐化。20d左右開始分化出帶3～4片真葉的芽。

（3）增殖培養(yǎng)　將高3cm以上的芽切下，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA），增殖系數(shù)13。

（4）生根培養(yǎng)　將高度3～4cm的叢生芽切成單株，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基（1/2MS＋0.5mg/L IBA＋0.05mg/L NAA），培養(yǎng)15d，植株基部形成少量愈傷組織，生根率98%，根系長(zhǎng)勢(shì)較好。

（5）煉苗及移栽　待苗長(zhǎng)出4～5 條根，平均根長(zhǎng)2～3cm時(shí)，經(jīng)煉苗后移栽到栽培基質(zhì)上，15d后，成活率 97.1%，苗長(zhǎng)勢(shì)較好。

以上培養(yǎng)基均加0.7%卡拉膠，pH 5.8，愈傷組織誘導(dǎo)及叢生芽增殖添加3%蔗糖，生根培養(yǎng)添加1.5%蔗糖。培養(yǎng)條件：（25±2）℃，光照14h/d，光照強(qiáng)度1500～2000lx。

17．黑果枸杞

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）是茄科（Solanceae）枸杞屬多年生落葉植物，常生于鹽堿荒地、鹽化沙地等各種鹽漬化土壤或荒漠環(huán)境，具有防風(fēng)固沙作用，是我國(guó)荒漠地區(qū)特有的野生植物。黑果枸杞是迄今為止發(fā)現(xiàn)的原花青素含量最高的天然野生植物，遠(yuǎn)超藍(lán)莓等植物。

培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒及種子萌發(fā)　將黑果枸杞種子用0.1% HgCl2消毒7～8min，無(wú)菌水沖洗3～5次，置于無(wú)菌水中浸泡3～4h，然后接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基（MS）。約8d后，幼苗萌發(fā)。

（2）愈傷組織誘導(dǎo)　將無(wú)菌苗的下胚軸切成0.5cm的小段，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋1mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA）。15d形成愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率100%。

（3）叢生芽誘導(dǎo)　將愈傷組織接種于叢生芽分化培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA），培養(yǎng)35d后開始形成芽，增殖系數(shù)為7.73。

（4）生根培養(yǎng)　當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至2～3cm長(zhǎng)時(shí)，將其從基部切下插入生根培養(yǎng)基（1/2MS＋1mg/L IBA），45d開始生根，生根率90%。煉苗之后移栽，成活率達(dá)90%。

以上培養(yǎng)基均加3%蔗糖和0.225%植物凝膠，pH 5.8。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間12h/d，種子萌發(fā)溫度（25±2）℃，其他培養(yǎng)溫度為23～25℃。

18．番木瓜

番木瓜（Carica papaya）是番木瓜科（Caricaceae）番木瓜屬多年生常綠大型草本植物，營(yíng)養(yǎng)豐富，為藥食兼用的果蔬植物。由于有雄株、雌株和兩性株3種株型，用常規(guī)種子繁殖不能保證株型一致；而采用扦插、嫁接等常規(guī)無(wú)性繁殖方法成活率低，易感染病毒。利用植物組培技術(shù)繁殖種苗是優(yōu)質(zhì)番木瓜規(guī)?；a(chǎn)的最有效的方法，其培養(yǎng)方法及步驟如下：

（1）外植體消毒　選取新鮮、成熟番木瓜果實(shí)，先用洗衣粉進(jìn)行表面清洗，然后流水沖洗1h；接著轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)用70%乙醇擦拭表面進(jìn)行初步消毒；最后用經(jīng)消毒的刀將其剖開，取出種子，小心將表面透明包衣去除，獲得番木瓜種子。種子浸泡于1.0mg/L 6-BA與1.0g/L GA3等體積混合液中18h后，接種至種子萌發(fā)培養(yǎng)基（1/2MS）。種子發(fā)芽率高達(dá)93.3%，接種培養(yǎng)后污染率低至3.3%。

（2）芽誘導(dǎo)培養(yǎng)　無(wú)菌苗長(zhǎng)至4～5節(jié)后，切成至少含兩個(gè)節(jié)的帶節(jié)莖段，平放至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋0.2mg/L NAA）。培養(yǎng)30d，芽數(shù)較多，基部有少量愈傷組織，在后續(xù)培養(yǎng)中切除愈傷組織對(duì)生長(zhǎng)無(wú)影響。

（3）增殖壯苗培養(yǎng)　叢生芽長(zhǎng)出后，將叢生芽切下，分成均勻的含有2～3個(gè)不定芽的小簇，接種到增殖培養(yǎng)基（MS＋0.2mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA＋40.0g/L蔗糖），增殖系數(shù)最高4.3。

（4）生根培養(yǎng)　選取經(jīng)增殖的健壯不定芽，小心切除附于上面的愈傷組織，切成長(zhǎng)2～3cm、帶2～3片葉子的莖段，接種到生根培養(yǎng)基（MS＋1.0mg/L IBA＋0.05mg/L KT＋2.0g/L AC）。7d左右開始在芽基部出現(xiàn)突起的根原基，14d開始出現(xiàn)細(xì)小的根，繼而根系增多，生根率達(dá)80.0%。

以上培養(yǎng)基均加0.7%卡拉膠，pH 5.8；增殖壯苗培養(yǎng)基添加4%蔗糖，其他培養(yǎng)基添加3%蔗糖。

19．互葉白千層

互葉白千層（Melaleuca altennifolia）屬桃金娘科白千層屬常綠灌木至小喬木，是從澳大利亞成功引進(jìn)的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的芳香植物，其新鮮枝葉和樹干提取的精油，俗稱“茶樹油”。培養(yǎng)方法及步驟：

（1）外植體消毒　選取高精油互葉白千層優(yōu)良單株，取當(dāng)年生的幼態(tài)萌條，將其剪成5～6cm長(zhǎng)的莖段，用75%乙醇浸泡30～60s，0.1%升汞溶液中振蕩消毒8～15min，無(wú)菌水沖洗5次以上，最后剪切成長(zhǎng)1.5～2.0cm的莖段作為外植體。

（2）莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)　外植體接種于培養(yǎng)基（MS＋1.0mg/L 6-BA＋0.05mg/L NAA）上，可獲得較高的誘導(dǎo)率。不同互葉白千層優(yōu)良單株誘導(dǎo)的芽形態(tài)不同，有的以單芽為主，有的以叢生芽為主。

（3）繼代增殖培養(yǎng)　3個(gè)高精油無(wú)性系誘導(dǎo)培養(yǎng)40d或小芽長(zhǎng)0.4～0.5cm時(shí)轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基（B1＋1.5mg/L 6-BA＋0.01mg/L NAA），其增殖系數(shù)分別為4.1、5.3、5.6，且有效芽苗率（高1cm的芽苗為有效芽苗）均達(dá)90%以上。在繼代培養(yǎng)基中添加0.4～0.6mg/L GA3，芽苗整齊、粗壯，平均每瓶有效芽苗數(shù)達(dá)17～22株。

（4）生根培養(yǎng)　取高1.0cm以上的小苗，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基（1/2 MS＋0.5mg/L ABT＋0.5mg/L NAA）中生根，但不同無(wú)性系生根率差異較大。

（5）煉苗和移栽　以純黃心土為移栽基質(zhì)，煉苗30d，3個(gè)無(wú)性系平均移栽成活率高達(dá)84.8%。　

誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基含蔗糖30g/L，生根培養(yǎng)基含糖15g/L，pH值均為5.7～5.8，瓊脂5.5～6.0g/L。培養(yǎng)溫度白天（27±2）℃，夜晚（22±2）℃，繼代培養(yǎng)光照強(qiáng)度1500～2000lx，生根培養(yǎng)前7d放置在無(wú)直射光源處，培養(yǎng)15d后，以自然散射光為輔助光源，光照強(qiáng)度約為3000lx。

20．降香黃檀

降香黃檀（Dalbergia odorifera）屬蝶形花科落葉喬木，國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹種，為中國(guó)最常見珍貴的紅木品種。

（1）外植體消毒　選取8～9月降香黃檀半木質(zhì)化枝條，用自來(lái)水沖洗5～10min，洗滌劑溶液浸泡10～15min，自來(lái)水沖洗干凈，0.1%新潔爾滅浸泡15～20min，自來(lái)水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇浸泡30s，0.1%升汞10～12min，無(wú)菌水沖洗4～5次。切去莖段上下兩端，保留長(zhǎng)度約為1cm左右的帶腋芽莖段作為外植體。

（2）腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)　外植體接種于改良DCR（增加KNO3 460mg/L）＋2.0mg/L 6-BA＋0.1mg/L的培養(yǎng)基中，莖基部產(chǎn)生愈傷組織，腋芽萌發(fā)，莖葉綠色，生長(zhǎng)基本正常。

（3）繼代培養(yǎng)　將外植體誘導(dǎo)生長(zhǎng)正常的莖芽切下，轉(zhuǎn)入改良的繼代增殖培養(yǎng)基中（MS1＋0.5mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA），該培養(yǎng)基作為繼代培養(yǎng)基經(jīng)多次繼代培養(yǎng)不產(chǎn)生褐化現(xiàn)象。

（4）生根培養(yǎng)　當(dāng)繼代莖芽高1.5cm時(shí)，切下接種于改良MS＋0.5g/L AC，含適量植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中生根。該方法生根率90%，生根過程中芽基部仍然有少數(shù)愈傷組織出現(xiàn)。

誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基含蔗糖30g/L，生根培養(yǎng)基含糖20g/L，pH值均為5.8，瓊脂3.5g/L。培養(yǎng)溫度（26±2）℃，外植體誘導(dǎo)第一周無(wú)光照，以后光照強(qiáng)度均為20～25μmol/（m2·s），光照時(shí)間12h/d。

二、植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物

1．茶樹愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)茶氨酸

茶氨酸是一種非蛋白氨基酸，主要存在于山茶科植物中，占干茶稱重的1%～2%，具有多種生理功效，包括抗氧化、抗腫瘤、降壓安神、減少體脂、提高機(jī)體免疫與抗衰老等。茶氨酸可抑制其他食品中的苦味和辣味，改善食品風(fēng)味，在食品和醫(yī)藥行業(yè)中具有很高的應(yīng)用前景。

以龍井茶的春梢嫩葉為外植體，經(jīng)常規(guī)表面消毒后接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，愈傷組織形成的起始時(shí)間在10～20d內(nèi)變化。愈傷組織初期生長(zhǎng)緩慢，組織堅(jiān)實(shí)，繼代培養(yǎng)后愈傷組織逐漸疏松，生長(zhǎng)速度加快。用蔗糖、葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源，其生長(zhǎng)速率、茶氨酸含量接近；用乳糖作為碳源時(shí)，其生長(zhǎng)速率、茶氨酸含量都低于蔗糖、葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基。茶氨酸在愈傷組織中的積累以溫度20～28℃較好，最佳積累茶氨酸的溫度是25℃。光照有利于愈傷組織生長(zhǎng)，但對(duì)茶氨酸積累不利。暗培養(yǎng)不利于愈傷組織的生長(zhǎng)，但茶氨酸積累卻大幅度提高。茶愈傷組織在暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基添加6%蔗糖、2mg/L IAA、4mg/L 6-BA、25mmol/L前體物質(zhì)（鹽酸乙胺），愈傷組織的生長(zhǎng)周期與茶氨酸的積累曲線幾乎同步。茶氨酸在第5周達(dá)到高峰，其量達(dá)到201.6mg/g。

龍井品種“碧云”嫩葉經(jīng)表面消毒后誘導(dǎo)成愈傷組織，3周繼代培養(yǎng)一次。將塊狀愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基（MS＋2mg/L IBA＋4mg/L 6-BA＋25mmol/L 鹽酸乙胺），采用水平振蕩，轉(zhuǎn)速90～110r/min，振幅2～4cm，100mL錐形瓶中加入30mL培養(yǎng)基，2周繼代培養(yǎng)一次。經(jīng)液體振蕩培養(yǎng)后，細(xì)胞分散情況好，大塊的聚集體少，總細(xì)胞量最高。取繼代培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物，經(jīng)傾倒法棄掉瓶底沉積的塊狀聚集體，搖勻后，取250mL錐形瓶，以30%裝液量裝入液體培養(yǎng)基，以占培養(yǎng)基總體積33%的接種量接入懸浮細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。茶細(xì)胞總量在15～21d時(shí)達(dá)到最高值，而茶氨酸積累的最高值出現(xiàn)在27d前后，這說(shuō)明茶細(xì)胞的代謝產(chǎn)物茶氨酸的合成具有滯后性，但在21d時(shí)茶氨酸積累也已達(dá)到27d時(shí)的98.45%。經(jīng)培養(yǎng)基成分優(yōu)化后，每克干茶細(xì)胞中茶氨酸含量可達(dá)233.25mg。因此，錐形瓶裝其體積30%的培養(yǎng)液，接入1/3培養(yǎng)液體積的懸浮細(xì)胞，在轉(zhuǎn)速90～110r/min、溫度（26±1）℃的搖床上培養(yǎng)3周后，收獲較為理想。

2．甘草培養(yǎng)生產(chǎn)甘草酸

甘草為植物烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L．）的干燥根及根莖。以烏拉爾甘草分布最廣，產(chǎn)量最多，質(zhì)量最好。

烏拉爾甘草種子經(jīng)消毒后接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待萌發(fā)后切取下胚軸0.5cm的小段接于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋2，4-D 2mg/L＋KT 0.7mg/L＋3%蔗糖＋1%瓊脂，pH5.8）上黑暗培養(yǎng)。4周于繼代培養(yǎng)基（MS＋NAA 2mg/L＋KT 0.7mg/L＋3% 蔗糖＋1%瓊脂，pH5.8）上繼代1次，培養(yǎng)條件同上。

將2g新鮮愈傷組織轉(zhuǎn)入含50mL液體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速110r/min，光照條件為12h/d。在懸浮培養(yǎng)初期，對(duì)懸浮液進(jìn)行過濾，濾去較大的細(xì)胞團(tuán)，得到分散性較好的懸浮細(xì)胞體系。每16d繼代1次，繼代時(shí)，原培養(yǎng)基與新鮮培養(yǎng)基的比例為 1∶3。在培養(yǎng)的第5d分別添加水楊酸、酵母提取物、水解酪蛋白等，培養(yǎng)16d后測(cè)定甘草酸含量，表明添加物均能較顯著地促進(jìn)甘草細(xì)胞中甘草酸的積累。其中添加10mg/L水楊酸，甘草酸的含量為對(duì)照組的1.86倍；添加酵母提取物可使甘草酸的含量達(dá)到14.20μg/g，是對(duì)照組的3.71倍；添加100mg/L水解酪蛋白，含量為對(duì)照組的1.69倍。經(jīng)對(duì)比表明，在培養(yǎng)的第5d添加酵母提取物（1mg/L）促進(jìn)甘草細(xì)胞中甘草酸積累的效果最佳。

3．人參細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂苷

人參（Panax Ginseng C．A.Meyer）為五加科植物，其干燥根和根莖是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中草藥，人參中含多種有效活性成分，如皂苷、多糖和脂溶性成分等。人參皂苷是人參的主要有效成分，人參所表現(xiàn)出的藥理活性主要是人參皂苷作用的結(jié)果。

將5年生新鮮人參洗凈，經(jīng)外植體消毒后，切成1cm×1cm的小塊，將其接種在培養(yǎng)基（MS＋2，4-D 1.0mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂6.5g/L）上誘導(dǎo)愈傷組織。愈傷組織在培養(yǎng)基（MS＋2，4-D 1.0mg/L＋KT 0.3mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂6.5g/L）上繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)3次后，將愈傷組織打碎后接種至含50mL 液態(tài)繼代培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在100r/min的搖床上培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，相對(duì)濕度70%，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)20d后收集懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞4g用于重新懸浮培養(yǎng)。經(jīng)測(cè)定，人參細(xì)胞的鮮重與干重的變化趨勢(shì)類似，隨著培養(yǎng)期延長(zhǎng)呈增加的趨勢(shì)，在培養(yǎng)0～10d時(shí)，細(xì)胞的鮮重與干重增加緩慢，人參皂苷含量變化不大；在培養(yǎng)10～25d時(shí)，鮮重與干重迅速增加，鮮重（11.1g/L）和干重（496.0mg/L）在25d時(shí)達(dá)到最大，25d后鮮重和干重不再繼續(xù)增加，而人參皂苷在10～20d增加迅速，20d時(shí)達(dá)到6.6mg/g DW，在20～25d人參皂苷含量和生產(chǎn)量下降，25d后保持穩(wěn)定。因此，為了得到最大量的人參皂苷，人參細(xì)胞培養(yǎng)以20d為宜。經(jīng)過對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，使用有濾脫的瓶蓋、采用6g接種量和120r/min更有利于人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和人參皂苷的合成。

4．雞血藤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)異黃酮類化合物

雞血藤是蝶形花科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤莖，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，有祛風(fēng)活血、舒筋活絡(luò)之功效。雞血藤其藥理作用的關(guān)鍵活性成分是異黃酮類化合物，主要包括大豆黃酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂異黃酮這4種主要的異黃酮活性成分。

取密花豆嫩葉，經(jīng)外植體消毒后，嫩葉切成5mm×5mm的方塊接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋1.0mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA）。先遮光培養(yǎng)4d，再進(jìn)行光照培養(yǎng)，每天光照12h，強(qiáng)度1200～1500lx，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。14d后在葉片邊緣膨大形成小芽點(diǎn)，30d左右完全形成愈傷組織，顏色幽綠。向培養(yǎng)基中添加0.10g/L VC后，愈傷組織誘導(dǎo)率提高到95%，且褐化現(xiàn)象最低，愈傷組織生長(zhǎng)良好。在暗培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)，每15d繼代培養(yǎng)一次。愈傷組織經(jīng)篩選后獲得淺黃色、疏松顆粒狀的培養(yǎng)物。

將篩選后的愈傷組織5g接入300mL錐形瓶中，含100mL液體培養(yǎng)基（MS＋0.5g/L NAA＋1.0mg/L 6-BA＋30g/L蔗糖＋0.1g/L VC＋3g/L水解酪蛋白），于（25±1）℃暗環(huán)境下以100r/min的速度進(jìn)行搖瓶懸浮培養(yǎng)12d。雞血藤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)S形分布，培養(yǎng)0～3d為細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期，生長(zhǎng)緩慢，異黃酮合成也未開始。第4d進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞快速生長(zhǎng)，生物量在培養(yǎng)的第8d達(dá)到最大（12.03g/L），異黃酮含量也在培養(yǎng)的第4d開始快速上升。指數(shù)生長(zhǎng)期過后即快速進(jìn)入衰亡期，穩(wěn)定期較短，生物量從培養(yǎng)的第8d開始衰減，但異黃酮合成繼續(xù)進(jìn)行，異黃酮含量在培養(yǎng)的第12d達(dá)到最大（5.34mg/L）。經(jīng)對(duì)比研究，在懸浮培養(yǎng)的第3d協(xié)同添加適量誘導(dǎo)子和前體（茉莉酸甲酯100μmol/L＋苯丙氨酸300μmol/L＋乙酸鈉100μmol/L），培養(yǎng)21d，異黃酮含量達(dá)到最高值（19.32mg/L），為對(duì)照組的3.62倍。

5．藏紅花培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花色素

藏紅花（Crocus sativus L）是鳶尾科番紅花屬球根類多年生草本植物，其干燥柱頭作為傳統(tǒng)名貴藥材，其提取物及其提純組分藏紅花素（crocin）、藏紅花苦素（picrocrocin）、藏紅花酸（crocetin）等具有良好的抗腫瘤功效，我國(guó)藏紅花栽培量少，產(chǎn)量極低，又因?yàn)槠滟Y源極其有限，不能滿足藏紅花市場(chǎng)需求。

將藏紅花球莖表面消毒后切成0.5～1cm的小塊；球莖表面消毒后切下芽點(diǎn)，置于萌發(fā)培養(yǎng)基上形成無(wú)菌芽，將無(wú)菌芽切成0.5～1cm的小段；藏紅花球莖萌發(fā)形成4～6cm的幼葉，經(jīng)外植體消毒后，切成0.5～1cm的小段。以球莖、花芽中幼葉和無(wú)菌芽為外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。無(wú)菌芽和幼葉的愈傷組織誘導(dǎo)率高于球莖，誘導(dǎo)時(shí)間較短，但形成的愈傷組織性狀不穩(wěn)定，容易褐化。添加2.0mg/L 2，4-D和0.5mg/L 6-BA的MS有利于球莖愈傷組織誘導(dǎo)，30d愈傷組織誘導(dǎo)率70%以上，愈傷組織色澤橙黃，質(zhì)地疏松，不透明。愈傷組織培養(yǎng)基為MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L NAA＋30g/L 蔗糖＋6.5g/L瓊脂，pH 5.8～6.0，（20±1）℃，黑暗條件下培養(yǎng)，每28d繼代一次。

懸浮培養(yǎng)采用改良的1/2B5培養(yǎng)基[KNO3、MgSO4、（NH4）2SO4、NaH2PO4用量減半]，添加20g/L蔗糖、0.5mg/L 6-BA、2.0mg/L IAA，pH 5.8～6.0，分裝于250mL錐形瓶，每瓶50mL。愈傷組織接種量為12%，黑暗振蕩培養(yǎng)25～30d，120r/min，溫度（20±1）℃。分別添加一定量的殼聚糖、殼寡糖、茉莉酸甲酯、水楊酸和Cu2＋等5種誘導(dǎo)子，低濃度誘導(dǎo)子對(duì)藏紅花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。其中茉莉酸甲酯誘導(dǎo)效果最好，在細(xì)胞培養(yǎng)第0d添加終濃度100μmol/L 茉莉酸甲酯，藏紅花色素含量達(dá)到28.57mg（以1g干細(xì)胞計(jì)），比對(duì)照提高177.9%。

6．蛇足石杉離體培養(yǎng)產(chǎn)石杉?jí)A甲

蛇足石杉（Huperzia serrata）為石杉科石杉屬的多年生小型蕨類植物。在我國(guó)主要分布于福建、兩廣、東北和長(zhǎng)江流域等地區(qū)。全草可供藥用，治療跌打損傷、毒蛇咬傷、燒傷燙傷、瘀血腫痛、內(nèi)傷吐血等。目前，已從蛇足石杉中提取了幾十種生物堿和一些萜類等活性物質(zhì)。其中從蛇足石杉中提取的石杉?jí)A甲是一種可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑，對(duì)老年癡呆癥的治療非常有效，被公認(rèn)是最有前途的天然抗老年癡呆癥藥物之一。

蛇足石杉植株秋季的半木質(zhì)嫩莖，經(jīng)表面消毒后接種到葉狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（6，7-V＋I(xiàn)AA 0.5mg/L）中。60d后蛇足石杉外植體分化出簇生葉狀體，葉狀體誘導(dǎo)率為50%。取誘導(dǎo)產(chǎn)生的葉狀體分割成小塊進(jìn)行增殖培養(yǎng)。葉狀體在添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（如ZT、2，4-D、NAA、IAA）（0.1～1.0mg/L）的不同濃度培養(yǎng)基上相對(duì)增長(zhǎng)率均低于未添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基。在含有20g/L蔗糖、不加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，增長(zhǎng)率達(dá)到了1336%。進(jìn)一步優(yōu)化表明：1/2MS基本培養(yǎng)基對(duì)葉狀體相對(duì)增殖率最好，平均為2087%，但是未檢測(cè)出石杉?jí)A甲；在1/4MS中生長(zhǎng)的葉狀體檢測(cè)到石杉?jí)A甲，1.18μg/g。相同光照強(qiáng)度的紅光、藍(lán)光、白光作光源培養(yǎng)葉狀體，培養(yǎng)70d后檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物。白光培養(yǎng)的蛇足石杉葉狀體生長(zhǎng)量及石杉?jí)A甲累積量均最高，相對(duì)增殖率達(dá)到1548%，石杉?jí)A甲達(dá)到1.94μg/g。12h/d光照時(shí)間的葉狀體累積石杉?jí)A甲的能力優(yōu)于15h/d光照的葉狀體。經(jīng)條件優(yōu)化后，培養(yǎng)30d的葉狀體開始快速增殖，60d后增長(zhǎng)量開始減慢，75d后葉狀體基本不增長(zhǎng)，葉狀體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，葉狀體的相對(duì)增殖量達(dá)到127.3g/L。60d后石杉?jí)A甲的累積量開始迅速增加，85d達(dá)到最大量7.57μg/g，以后呈快速下降趨勢(shì)。因此，1/4MS培養(yǎng)基，12h/d的白光光照培養(yǎng)85d的葉狀體增殖及石杉?jí)A甲含量最高。

三、原生質(zhì)體的培養(yǎng)

1．霸王的原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生

將霸王（Sarcozygium xanthoxylon Bunge）萌發(fā)的無(wú)菌苗子葉切成小塊，誘導(dǎo)形成愈傷組織。誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS＋2.0mg/L 2，4-D＋0.2mg/L 6-BA＋3%蔗糖＋0.65%瓊脂，pH5.8～6.2。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含1.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L 6-BA、500mg/L CH的相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，3周繼代1次。選擇淡黃綠色、生長(zhǎng)旺盛、易分散的愈傷組織用于原生質(zhì)體分離。

取繼代培養(yǎng)14d的松軟愈傷組織1～2g，置于盛有10mL酶液（2%纖維素酶、1%半纖維素酶、1%果膠酶、0.5mol/L甘露醇、0.1%MES、0.05mol/L CaCl2、pH值5.8）的錐形瓶中，在（25±2）℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)12h，在恒溫?fù)u床上50r/min振蕩1h，游離原生質(zhì)體。酶解液用300目不銹鋼篩過濾，于800r/min離心10min，收集原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體懸浮于洗液中（0.16mol/L CaCl2，0.1% MES，pH5.8），用18%蔗糖溶液離心（50r/min離心15min）漂浮純化原生質(zhì)體，將漂浮的原生質(zhì)體吸至新管，用洗液洗滌1次，再用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌1次，隨后計(jì)數(shù)原生質(zhì)體產(chǎn)率和活力。每克愈傷組織可分離出2.36×106個(gè)原生質(zhì)體，酚藏花紅染色結(jié)果顯示原生質(zhì)體活力在85%以上。

純化后的原生質(zhì)體重新懸浮于培養(yǎng)液中，并調(diào)整原生質(zhì)體至合適的密度，置于直徑6cm的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿2mL。此過程在（25±2）℃暗條件下進(jìn)行。原生質(zhì)體培養(yǎng)液為DPD的基本成分，同時(shí)都附加2.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L 6-BA、500mg/L CH、2%蔗糖、0.5mol/L甘露醇，pH值5.8。培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)原生質(zhì)體再生細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、分裂以及克隆形成影響較大，比較6-BA（0.1～0.5mg/L）、NAA（0.5～2.0mg/L）、2，4-D（0.5～2.0mg/L）和KT（0.2～1.0mg/L）等不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在原生質(zhì)體培養(yǎng)中的影響。結(jié)果表明，2，4-D對(duì)原生質(zhì)體的分裂頻率影響較大，當(dāng)2，4-D的濃度從0.5mg/L增至1.0mg/L時(shí)，原生質(zhì)體的分裂頻率由12.8%提高到28.4%，而當(dāng)2，4-D過高（2.0mg/L）時(shí)反而會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)導(dǎo)致分裂頻率降低。6-BA、NAA以及KT等對(duì)原生質(zhì)體的分裂也均有較為明顯的影響，例如KT的加入有助于提高分裂頻率。在1.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L 6-BA和0.2mg/L KT組合中，霸王原生質(zhì)體的最佳培養(yǎng)密度為2×105個(gè)/mL，此條件下培養(yǎng)7d發(fā)生分裂頻率可達(dá)28.4%。原生質(zhì)體培養(yǎng)24h后，體積增大并變成橢圓形，細(xì)胞壁合成，3～4d出現(xiàn)第1次細(xì)胞分裂，之后持續(xù)分裂。原生質(zhì)體培養(yǎng)2周左右形成小細(xì)胞團(tuán)，大約4周后形成直徑2mm的肉眼可見的小愈傷組織。移至弱光下繼續(xù)培養(yǎng)，愈傷組織能進(jìn)一步形成淡黃色質(zhì)地疏松的愈傷組織。將愈傷組織置于MS固體繼代培養(yǎng)基上擴(kuò)增，并移至光照條件下培養(yǎng)，愈傷組織可轉(zhuǎn)變成淡黃綠色。大約經(jīng)3周后將愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上。在2500lx光照下，培養(yǎng)2周后出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，繼而形成叢生芽。當(dāng)叢生芽長(zhǎng)到1～2cm高時(shí)，移入生根培養(yǎng)基，約15d有不定根出現(xiàn)，3周后形成完整植株。

2．“過山香”香蕉原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生

“過山香”香蕉吸芽經(jīng)外植體消毒后，將頂芽莖尖平均縱切為4塊，接種到不定芽分化培養(yǎng)基（MS＋6-BA 22.2μmol/L＋NAA 0.05μmol/L）中誘導(dǎo)不定芽的分化；分化的不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基（MS＋6-BA 17.8μmol/L＋NAA 0.10μmol/L＋腺嘌呤 29.85μmol/L）擴(kuò)繁。挑選增殖培養(yǎng)第3代且幼嫩粗壯的不定芽，切除上部葉鞘至基部1cm處，逐層剝離剩余葉鞘組織后置于繼代培養(yǎng)基（MS＋6-BA 100μmol/L＋I(xiàn)AA 1μmol/L）中培養(yǎng)。經(jīng)過一定次數(shù)的繼代培養(yǎng)后可獲得類似花椰菜結(jié)構(gòu)的多芽體。用尖嘴手術(shù)刀將多芽體從接合部位分離，切取單個(gè)球狀莖頂端3mm×3mm×1.5mm（長(zhǎng) ×寬 ×厚）的薄切片，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1/2MS＋VC 10mg/L＋2，4-D 5mg/L和ZT 1mg/L＋瓊脂粉 7.0g/L）中培養(yǎng)。挑選易松散的白色或淺黃色愈傷組織為“過山香”香蕉的胚性愈傷組織，用于原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)。

取貢蕉花蕾中剛坐完果的雌花，剝?nèi)』ㄐ蝽敹?.5cm長(zhǎng)的部分，經(jīng)外植體消毒后，將花梳置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在小花基部開始出現(xiàn)乳白色或淺黃色圓球形、質(zhì)地致密的分生小球體。經(jīng)過2～3個(gè)月的培養(yǎng)，在小球體旁出現(xiàn)松散易碎的淺黃色愈傷組織。經(jīng)多次繼代和篩選培養(yǎng)可得到大量淺黃色的貢蕉的胚性愈傷組織，用作原生質(zhì)體培養(yǎng)的看護(hù)細(xì)胞。

“過山香”香蕉胚性愈傷組織和貢蕉胚性愈傷組織在液體培養(yǎng)基（MS＋100mg/L麥芽水解物＋680μmol/L谷氨酰胺＋4.1μmol/L生物素＋4.5μmol/L 2，4-D＋130mmol/L蔗糖）中，黑暗、（27±2）℃條件下培養(yǎng)，每15d繼代一次。

在最近繼代的4～7d時(shí)取香蕉胚性愈傷組織，用200μm的篩網(wǎng)過濾后，取細(xì)胞密實(shí)體積0.5mL的胚性愈傷組織加入到10mL酶液（3.5%纖維素酶 R-10、1%離析酶R-10、0.15%果膠酶Y-23、204mmol/L KCl、67mmol/L CaCl2、0.41mol/L甘露醇，pH 5.6～5.8）中，酶解8～11h后，采用過濾離心法進(jìn)行原生質(zhì)體的洗滌和純化。剛分離的原生質(zhì)體球形，細(xì)胞質(zhì)濃厚，內(nèi)含物豐富，細(xì)胞大小不一。原生質(zhì)體產(chǎn)量為3.1×107個(gè)/mL胚性愈傷組織，活力85%以上。

將原生質(zhì)體密度調(diào)整到1×105個(gè)/mL，以貢蕉胚性愈傷組織作看護(hù)培養(yǎng)細(xì)胞，在制作好的看護(hù)培養(yǎng)基上覆蓋混合纖維素濾膜，將1mL原生質(zhì)體懸浮液轉(zhuǎn)移到混合纖維素濾膜上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成為：MS＋100mg/L麥芽水解物＋680μmol/L谷氨酰胺＋4.1μmol/L生物素＋0.5mmol/L MES＋4.5μmol/L 2，4-D＋117mmol/L蔗糖＋0.4mol/L葡萄糖，pH5.7，過濾滅菌。經(jīng)過3d的培養(yǎng)，原生質(zhì)體變成橢圓形的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)濃厚，內(nèi)含物豐富；經(jīng)過7d左右的培養(yǎng)，原生質(zhì)體開始第一次分裂，隨后進(jìn)行第二次分裂；經(jīng)過20d的培養(yǎng)，成為肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)；45d時(shí)可見大量的肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)。所形成的細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞質(zhì)濃厚、球形，具有典型的胚性細(xì)胞特征，轉(zhuǎn)移到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上能進(jìn)一步分化。

經(jīng)看護(hù)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞團(tuán)在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20～25d左右，可見到長(zhǎng)橢圓形、直徑大約1.0～1.5mm的發(fā)育成熟的體胚。這些體胚在新鮮的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上再經(jīng)過30d的培養(yǎng)，7.8%的體胚萌發(fā)。萌發(fā)的體胚在培養(yǎng)基（MS＋0.1%活性炭）上30d后發(fā)育為10～12cm高的幼苗；在溫室馴化培養(yǎng)3個(gè)月后長(zhǎng)成健壯的植株。

3．番石榴原生質(zhì)體培養(yǎng)

將番石榴“Beaumont”無(wú)菌叢生芽葉片剪成0.5mm的細(xì)條，轉(zhuǎn)入含有5mL酶解液[酶占比6%，離析酶∶纖維素酶∶半纖維素酶＝0.5∶0.4∶0.1，細(xì)胞原生質(zhì)體洗滌液（CPW）、0.75mol/L甘露醇或山梨醇，pH 5.8，過濾滅菌]的100mL錐形瓶中。在黑暗27℃條件下45r/min旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)10h，采用75μm不銹鋼濾網(wǎng)和40μm尼龍濾網(wǎng)過濾，過濾物轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，100g離心5min，棄去懸浮物，原生質(zhì)體重新懸浮于無(wú)酶液的CPW等滲鹽溶液中。將2mL粗制原生質(zhì)體懸浮物置于4mL 25%糖溶液中，80g密度梯度離心3min，用去尖的巴氏吸管收集密度梯度中部的原生質(zhì)體，重懸于新鮮培養(yǎng)液中。原生質(zhì)體得率>3.7×106/mL，活力>90%?！?/p>

原生質(zhì)體培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基：MS中無(wú)NH4NO3，附加20mg/L VB1、10mg/L VB6、2mg/L煙酸、5mg/L泛酸、30mg/L VC、1.5mg/L谷氨酰胺、100mg/L肌醇、50mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖及山梨醇或甘露醇，pH 5.8，過濾滅菌。原生質(zhì)體培養(yǎng)在無(wú)菌狀態(tài)下用海藻酸鈉微球培養(yǎng)或涂布培養(yǎng)。

海藻酸鈉溶于等滲溶液中，濃度4%，過濾滅菌。用無(wú)鈣離子的培養(yǎng)液調(diào)整原生質(zhì)體密度為1×105個(gè)/mL，再與海藻酸鈉溶液混合?；旌衔镏鸬渭尤氲胶?0mmol/L CaCl2、無(wú)海藻酸鈉的培養(yǎng)液中。經(jīng)1h固化后，海藻酸鈣凝膠微球用培養(yǎng)基洗滌2次，每次10min，取10mL培養(yǎng)液含有10個(gè)凝膠微球，置于100mL錐形瓶中，每天光照4h，光照強(qiáng)度15μmol/（m2·s），27℃條件下30r/min旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。每4d用15%無(wú)甘露醇的培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液。

經(jīng)過3周的培養(yǎng)，海藻酸鈉鈣凝膠微球中長(zhǎng)出微小的細(xì)胞團(tuán)。2mL離心管中加入1.5mL 20mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 7.4），取3個(gè)海藻酸鈉鈣凝膠微球置于管中，每5min輕輕顛倒10次，使凝膠溶解，細(xì)胞團(tuán)釋放到溶液中。45g低速離心收集細(xì)胞團(tuán)，再用檸檬酸緩沖液清洗細(xì)胞團(tuán)1次。細(xì)胞團(tuán)重懸于0.5mL液體培養(yǎng)基中，將其加入到含有1mg/L NAA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行涂布培養(yǎng)。每平方厘米可形成肉眼可見的微小愈傷組織18個(gè)。經(jīng)過4周的培養(yǎng)，3個(gè)微小愈傷組織（大約3mm3）被置于芽再生培養(yǎng)基，其中含有3.4mg/L的KT和6-BA的混合物（KT∶6-BA＝0.6∶0.4），在27℃、光照時(shí)間16h/d、強(qiáng)度40μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)。8周后4片葉子或以上的芽數(shù)量>12。芽在培養(yǎng)基（MS＋0.1mg/L IBA）上生根，4周后移栽于混合栽培基質(zhì)（珍珠巖10%、泥炭土70%、蛭石20%）的花盆中，用1/8MS無(wú)機(jī)鹽溶液澆灌4周。

4．美國(guó)榆原生質(zhì)體的培養(yǎng)

美國(guó)榆無(wú)菌苗嫩葉剪碎用無(wú)菌水沖洗，然后懸浮于含有700mg/L MES的4.8%海藻酸鈉溶液（pH5.7）中，緩慢滴加1% CaCl2溶液，固化30min，形成海藻酸鈣微球。微球用無(wú)菌水洗滌3次，轉(zhuǎn)入125mL錐形瓶中，錐形瓶中含有25mL培養(yǎng)基，其成分為：MS無(wú)機(jī)鹽和維生素，3%蔗糖，5μmol/L 6-BA，1μmol/L NAA，100μmol/L 2-氨基吲哚2-磷酸（AIP），pH5.7。培養(yǎng)1個(gè)月后，在培養(yǎng)液中形成了濃的細(xì)胞懸浮物，以其為原生質(zhì)體分離的起始材料。懸浮培養(yǎng)物每2周繼代培養(yǎng)1次。

將細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50mL離心管中，90g離心6min，保留沉淀的細(xì)胞。細(xì)胞重新懸浮于過濾滅菌的混合酶液（包含CPW鹽溶液、91g/L甘露醇、500mg/L MES、2g/L纖維素酶、1g/L離析酶、0.3g/L果膠酶，pH5.5）中，再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中25℃黑暗靜置培養(yǎng)2h。用100μm尼龍網(wǎng)過濾獲得的懸浮物，并收集原生質(zhì)體，90g離心6min，1mL CPW重新懸浮原生質(zhì)體。轉(zhuǎn)入25mL CPW21洗液中，90g密度梯度離心10min。吸取兩項(xiàng)中間的原生質(zhì)體至15mL離心管中，加CPW溶液至10mL，90g離心6min，棄上清液。原生質(zhì)體重新懸浮于修改的KM5/5培養(yǎng)液（KM培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽和維生素、10%甘露醇、500mg/L MES、5μmol/L 6-BA、5μmol/L NAA，pH 5.7）中，調(diào)整密度至2×105個(gè)/mL。原生質(zhì)體懸浮液與含1.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖的CPW溶液等體積混合，混合液滴入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1滴，凝固后，每孔加入25μL KM5/5培養(yǎng)液。在黑暗條件下，10r/min回旋振蕩培養(yǎng)，每2周更換一次培養(yǎng)液，如發(fā)現(xiàn)褐化，則添加10μmol/L AIP。培養(yǎng)24h，可觀察到細(xì)胞壁形成，培養(yǎng)48h即可觀察到細(xì)胞分裂，培養(yǎng)6d，細(xì)胞分裂比例為37.5%，細(xì)胞形態(tài)正常。

經(jīng)培養(yǎng)，瓊脂糖凝膠微球中形成微小的愈傷組織，細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)逐漸釋放到液體培養(yǎng)基中。取含有細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入KM5/1培養(yǎng)基（KM培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽和維生素、3%蔗糖、5μmol/L 6-BA、1μmol/L NAA，0.22%植物凝膠，pH 5.7）中培養(yǎng)。愈傷組織轉(zhuǎn)入ERM培養(yǎng)基（MS無(wú)機(jī)鹽、3%蔗糖、10μmol/L或20μmol/L TDZ）進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，大約14%的愈傷組織形成不定芽。切去不定芽轉(zhuǎn)入?yún)采空T導(dǎo)的ESM培養(yǎng)基（DKW培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽和維生素、3%蔗糖、2.2μmol/L 6-BA、0.3μmol/L GA3、0.22%植物凝膠）。叢生芽在RM培養(yǎng)基（DKW培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽和維生素、3%蔗糖、0.5μmol/L IBA、0.6%活性炭、0.22%植物凝膠）上生根。經(jīng)過1～2個(gè)月的培養(yǎng)后進(jìn)行煉苗移栽，成活率51%。

5．合歡花的原生質(zhì)體培養(yǎng)

合歡花（Albizia julibrissin）種子用自來(lái)水沖洗20min，浸于85～90℃熱水中，自然降到室溫。然后將種子用70%乙醇浸泡3min，轉(zhuǎn)入20%的消毒液（含5.25%NaClO）中3min，無(wú)菌水沖洗3次，每次3min，吸干種子水分，接入MS基本培養(yǎng)基，在（26±2）℃、光照時(shí)間16h/d、光照強(qiáng)度40μmol/（m2·s）條件下進(jìn)行種子萌發(fā)。種子培養(yǎng)6～10d開始萌發(fā)，取培養(yǎng)4～5周頂端的全展葉片作為原生質(zhì)體的分離材料。如果用愈傷組織，則種子在黑暗環(huán)境下培養(yǎng)10～14d以獲得黃化的下胚軸，下胚軸剪成5～7mm，平放在培養(yǎng)基（MS＋0.2g/L肌醇＋10.8μmol/L NAA＋4.4μmol/L 6-BA）上，誘導(dǎo)白色、易碎的愈傷組織。

酶液組成為：1.5%纖維素酶R-10和1%果膠酶Y23，均溶于含有0.7mol/L甘露醇和5μmol/L MES的CPW溶液（pH 5.5～5.8）。酶液貯存于－20℃，每管5mL分裝，使用前在55℃水浴10min。

取1g葉片剪成小條，或1g愈傷組織置于20mL含有0.7mol/L甘露醇或山梨醇的CPW溶液中。在黑暗、（25±2）℃條件下，葉片小條預(yù)處理60min，愈傷組織預(yù)處理90min。取250mg預(yù)處理材料轉(zhuǎn)入含有5mL酶液的CPW溶液中，在黑暗、（25±2）℃條件下，40r/min搖床振蕩培養(yǎng)6h。再加入等體積含0.7mol/L甘露醇的CPW溶液，用0.75μm尼龍網(wǎng)過濾，去除雜質(zhì)，濾液轉(zhuǎn)入15mL含0.7mol/L甘露醇的CPW溶液的離心管中，100g離心5min，棄去上清液，保留原生質(zhì)體。用含0.7mol/L甘露醇的CPW溶液洗滌原生質(zhì)體，100g離心3 min，棄去上清液，用3mL KM液體培養(yǎng)基重新懸浮原生質(zhì)體。原生質(zhì)體密度7.77 × 105個(gè)/g組織鮮重，原生質(zhì)體活力94%。

原生質(zhì)體置于10mL CPW溶液中，室溫放置30min。KM8P基本培養(yǎng)基添加2.7μmol/L NAA、2.2μmol/L 6-BA、0.2%MES、1.4%瓊脂糖維持在45℃。調(diào)整原生質(zhì)體密度為3.5×105個(gè)/mL，將其與KM8P培養(yǎng)液1∶1室溫下混合，取2mL于60mm×12mm培養(yǎng)皿中靜置60min，加入相同成分的KM8P液體培養(yǎng)基5mL，加入8%蔗糖溶液10mL，輕混勻，用封口膜密封，在（25±2）℃、黑暗條件下30～40r/min振蕩培養(yǎng)。在小細(xì)胞團(tuán)形成過程中如發(fā)現(xiàn)褐化，重新更換KM8P液體培養(yǎng)基和蔗糖溶液。

培養(yǎng)過程中原生質(zhì)體逐漸生長(zhǎng)，在瓊脂糖中形成細(xì)胞團(tuán)并釋放到培養(yǎng)液中。如果液相中出現(xiàn)褐化時(shí)，更換50%（體積分?jǐn)?shù)）新鮮培養(yǎng)液。更換出的舊培養(yǎng)液用5mL離心管收集，40g離心，棄去上清液，管底的細(xì)胞團(tuán)用KM8P培養(yǎng)液洗滌，離心，收集細(xì)胞并用1mL KM8P培養(yǎng)液重新懸浮，涂布于無(wú)甘露醇的固體培養(yǎng)基，在100mm×12mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，6h/d光照，光照強(qiáng)度6～8μmol/（m2·s）。培養(yǎng)3周，葉片分離的原生質(zhì)體在每個(gè)培養(yǎng)皿中有52.3個(gè)小細(xì)胞團(tuán)形成，愈傷組織分離的原生質(zhì)體在每個(gè)培養(yǎng)皿中有49.3個(gè)小細(xì)胞團(tuán)形成。挑取直徑2～4mm的小細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)入含有B5有機(jī)成分和MS無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基，附加3%蔗糖、0.8%瓊脂、10.8μmol/L NAA、4.4μmol/L 6-BA、0.2g/L水解酪蛋白。培養(yǎng)過程中，愈傷組織2周繼代培養(yǎng)1次。在培養(yǎng)基（MS＋13.2μmol/L 6-BA＋4.6μmol/L ZT）上誘導(dǎo)不定芽。培養(yǎng)5周時(shí)，不定芽形成頻率為78%～93%，每塊愈傷組織上有芽3～4個(gè)。在生根培養(yǎng)基（1/2MS＋4.9μmol/L IBA）上進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)4～5周時(shí)，從葉片分離原生質(zhì)體來(lái)源的不定芽生根為68%，從愈傷組織分離原生質(zhì)體來(lái)源的不定芽生根率為61%。生根后煉苗移栽。

6．二倍體馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)

脫毒馬鈴薯RH2（IVP48-168）無(wú)菌苗，取培養(yǎng)20d左右的葉片，20℃黑暗條件下放置48h。然后轉(zhuǎn)入CM中4℃培養(yǎng)24h。再將葉片切成1～2mm細(xì)條，加入到過濾滅菌的酶液（0.35mol/L 甘露醇、2.0%纖維素酶、0.2%果膠酶）中酶解4h，溫度（20±1）℃，黑暗處理，40～45r/min振蕩。酶解后用300目篩過濾，將濾液轉(zhuǎn)入離心管，100g離心5min，收集原生質(zhì)體，稀釋、清洗2次，沿管壁緩慢滴入到加裝23%蔗糖6～8mL的離心管中懸浮，80g離心9min，收集中間界面的原生質(zhì)體，再洗滌2次，離心收集原生質(zhì)體。所獲得的原生質(zhì)體完整率達(dá)到68.8%，原生質(zhì)產(chǎn)量和活力分別為17.5×105和80.9%。原生質(zhì)體活力較高，總體效果較好。

將純化的原生質(zhì)體密度調(diào)整為1×104～1×105個(gè)/mL，在原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基上淺層靜止培養(yǎng)，7d后補(bǔ)充1/3新鮮培養(yǎng)基。原生質(zhì)體在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d左右，開始形成細(xì)胞壁，細(xì)胞逐漸由圓球形變?yōu)闄E球形。5～7d時(shí)細(xì)胞發(fā)生第一次分裂，然后持續(xù)發(fā)生二次分裂和多次分裂，15d左右形成多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)。將其懸液接種在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行固-液雙層培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)20d左右，形成肉眼可見的小愈傷組織。將愈傷組織挑出接種到增殖培養(yǎng)基上，在光照2000～3000lx、溫度（25±1）℃條件下培養(yǎng)。待愈傷組織長(zhǎng)至2～3mm時(shí)，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，愈傷組織逐漸變綠，結(jié)構(gòu)逐漸致密。培養(yǎng)50d左右，胚性愈傷組織開始分化出芽。將芽切下，放入MS培養(yǎng)基，7d左右生根，形成完整植株。RH2愈傷組織發(fā)育快，分化能力強(qiáng)，可獲得大量再生植株。

四、毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

1．烏拉爾甘草毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

烏拉爾甘草（Glycyrrihizag uralensis Fisch）是中國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥材，以根和莖入藥。其主要藥用成分為甘草酸和甘草黃酮。人工種植甘草周期較長(zhǎng)，且部分藥用成分含量遠(yuǎn)低于野生甘草，從而限制了甘草資源的開發(fā)與利用。選取飽滿的甘草種子，先用98%濃H2SO4處理30min，然后經(jīng)外植體消毒，接種于1/2MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)無(wú)菌苗，以株齡14d的活體幼苗、無(wú)菌苗子葉和下胚軸作為轉(zhuǎn)化外植體。

取出保存于－70℃冰箱中的原始發(fā)根農(nóng)桿菌15834、A4菌種，劃線接種于YMB固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2d，挑取單菌落接種于含Amp 50mg/L的YMB液體培養(yǎng)基中，28℃下180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值0.6～0.8。收集菌液，8000r/min離心10 min，棄上清液，加MS液體培養(yǎng)基稀釋菌液至OD600值0.6，加入乙酰丁香酮至濃度為100μmol/L，28℃下180r/min振蕩培養(yǎng)2h，用于甘草遺傳轉(zhuǎn)化。

用發(fā)根農(nóng)桿菌菌液對(duì)烏拉爾甘草幼苗的下胚軸進(jìn)行穿刺侵染2～3次，然后將幼苗接種于含乙酰丁香酮100μmol/L的1/2MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)5d。將幼苗轉(zhuǎn)至含300mg/L頭孢霉素的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7d后在幼莖穿刺部位誘導(dǎo)出大量白色的叢生毛狀根，剪取2～3cm長(zhǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入含300mg/L頭孢霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每周繼代培養(yǎng)1次，逐漸降低頭孢霉素濃度，直至無(wú)菌。剪取2～3cm的無(wú)菌毛狀根接種于1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該方法采用農(nóng)桿菌菌株15834轉(zhuǎn)化率達(dá)到79.5%，并且在培養(yǎng)的第5d即可在針刺部位形成白色根端，7d時(shí)發(fā)育成叢生毛狀根。

甘草無(wú)菌苗子葉切成0.5cm2的小塊，下胚軸切成約1.0cm的小段，用無(wú)菌針刺出小創(chuàng)口，分別侵入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，侵染15～20 min，吸干多余菌液，置于含乙酰丁香酮100μmol/L的MS培養(yǎng)基上，黑暗條件下共培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)接至含500mg/L頭孢霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，28℃、光照時(shí)間12h/d、光照強(qiáng)度2000lx條件下培養(yǎng)。剪取2～3cm的毛狀根轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12～14d后，陸續(xù)從外植體傷口處產(chǎn)生白色毛狀根，毛狀根分枝較多，且無(wú)向地性。發(fā)根農(nóng)桿菌15834和A4轉(zhuǎn)化時(shí)，以子葉為外植體的毛狀根誘導(dǎo)率分別為24.9%和14.3%，而下胚軸的轉(zhuǎn)化率更低。經(jīng)PCR檢測(cè)，毛狀根中存在發(fā)根農(nóng)桿菌T-DNA片段中的rolA和rolC基因序列，未檢測(cè)到發(fā)根農(nóng)桿菌病毒區(qū)VirD2基因片段，證實(shí)了發(fā)根農(nóng)桿菌中基因片段已整合到甘草基因組中。

剪取生長(zhǎng)迅速毛狀根根尖分別接種在不含植物生長(zhǎng)物質(zhì)的MS、1/2MS、1/2B5和B5培養(yǎng)液中，置于150mL錐形瓶中，每瓶裝培養(yǎng)液50mL，在（25±0.5）℃條件下110r/min振蕩暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為35d。烏拉爾甘草毛狀根在無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)最顯著，形成分枝較多，毛狀根的生物量最大，培養(yǎng)25d，毛狀根增殖倍數(shù)達(dá)到19.13倍（鮮重）；在MS培養(yǎng)液中增殖倍數(shù)達(dá)到11.57倍；在1/2B5培養(yǎng)液中生物量最低，培養(yǎng)7d毛狀根褐變嚴(yán)重，且根尖出現(xiàn)明顯愈傷組織，抑制了毛狀根生長(zhǎng)，增殖倍數(shù)僅為2.35倍。培養(yǎng)35d，毛狀根生物量與其最大值比較均有所下降。

2．催眠睡茄毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

催眠睡茄（Withania somnifera L．）為茄科睡茄屬植物，是印度傳統(tǒng)中草藥，可全草入藥。催眠睡茄含有睡茄素類、醉茄素類等各種生物堿，具有抗炎、抗壓、抗氧化、抗腫瘤等功效；睡茄素A是睡茄屬植物的主要藥用成分，集中在植株的根部。將發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1在含40mg/L利福平（Rif）的YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于10mL含40mg/L Rif的YEB液體培養(yǎng)基中，200r/min、27℃振蕩培養(yǎng)（以下條件相同）24h，取100μL菌液接種于50mL含40mg/L Rif的YEB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)約12h至A600為0.3左右，加入乙酰丁香酮（AS）至終濃度為100μmol/L，繼續(xù)活化3h。取50mL菌液4000 r/min離心10min，收集菌體，用50mL含100μmol/L AS的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)30 min，獲得菌液用于轉(zhuǎn)化催眠睡茄。

將培養(yǎng)20d的催眠睡茄幼苗的葉片浸入C58C1的菌液中，振蕩20min，用無(wú)菌濾紙吸干葉片表面的菌液，接種到含100μmol/L AS的MS固體培養(yǎng)基上，27℃黑暗條件下共培養(yǎng)4～5d，當(dāng)葉片周圍有菌圈出現(xiàn)時(shí)，取出葉片，無(wú)菌水200r/min振蕩洗滌3次，每次10min，吸干水分，接種到含300mg/L頭孢噻肟鈉（Cef）的MS固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，每4d更換1次培養(yǎng)基。培養(yǎng)10d左右開始有毛狀根出現(xiàn)，15d時(shí)毛狀根誘導(dǎo)率達(dá)30%，每塊外植體上平均誘導(dǎo)4條毛狀根，表現(xiàn)出無(wú)向地性、絨毛較多的特點(diǎn)。當(dāng)毛狀根生長(zhǎng)至3cm左右時(shí)，剪下分別接種到含300mg/L Cef的1/2MS培養(yǎng)基上，每7d剪取根尖繼代培養(yǎng)，繼代5～6次后，將毛狀根轉(zhuǎn)移至YEB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，無(wú)農(nóng)桿菌污染的毛狀根接種于1/2MS液體培養(yǎng)基中，110r/min、27℃振蕩培養(yǎng)。取催眠睡茄毛狀根進(jìn)行PCR檢測(cè)virD基因和rolB基因，排除農(nóng)桿菌基因組對(duì)毛狀根基因組污染，陽(yáng)性率為96.67%。選擇性狀保持穩(wěn)定且生長(zhǎng)迅速的陽(yáng)性毛狀根克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)30d，此時(shí)毛狀根出現(xiàn)輕微的褐化現(xiàn)象。收集毛狀根，經(jīng)冷凍干燥、粉碎、過篩后提取睡茄素A進(jìn)行HPLC檢測(cè)。檢測(cè)的10個(gè)毛狀根系中睡茄素A的含量都顯著高于野生催眠睡茄根的含量，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.588mg/g，是野生植株平均含量的1.96倍，其中毛狀根系M3的睡茄素A含量最高（1.783mg/g），是野生催眠睡茄植株平均含量的2.21倍、根的1.51倍。

3．人參毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

人參（Panax ginseng C．A.Meyer）是一種以人參皂苷為主要藥用成分的多年生植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，一般種植6年以后才能采收。人參栽培對(duì)土壤環(huán)境有著嚴(yán)格的要求，我國(guó)傳統(tǒng)栽培人參方法是開墾林地種植，對(duì)森林資源破壞極其嚴(yán)重。況且種植過人參的土地20～30年不能再次種植人參。人參的藥用部位是根生產(chǎn)毛狀根，從其中提取人參皂苷等次生代謝產(chǎn)物。

發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌用YEB液體培養(yǎng)基在120r/min、28℃振蕩黑暗培養(yǎng)過夜，所獲菌液用于人參遺傳轉(zhuǎn)化。取2年生的根消毒后，切成0.2～0.3mm薄片，接種于MS基本培養(yǎng)基上。將菌液通過微量注射器注入人參薄片中，將人參薄片在25℃、光照14h/d、光照強(qiáng)度2000lx或黑暗條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)毛狀根。培養(yǎng)6周時(shí)，毛狀根開始形成，誘導(dǎo)率達(dá)到31.6%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)光照與否對(duì)毛狀根的形成無(wú)明顯影響。當(dāng)毛狀根形成后，剪取1cm長(zhǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)移至含500mg/L羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每5～7d轉(zhuǎn)接一次，直至無(wú)菌。除菌后的毛狀根表現(xiàn)出多分枝、叢生、無(wú)向地性的特點(diǎn)，在1/2MS無(wú)植物生長(zhǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)，每4周繼代培養(yǎng)一次。人參毛狀根經(jīng)冠癭堿檢測(cè)和Southern雜交證實(shí)為轉(zhuǎn)基因根系。生長(zhǎng)速率比較發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)化之間生長(zhǎng)速率有明顯差異，其中根系R9923擁有最高的生長(zhǎng)速率。

人參毛狀根R9923液體振蕩培養(yǎng)4周，增長(zhǎng)速率達(dá)到28.8倍，人參皂苷含量達(dá)到1.54%，人參皂苷產(chǎn)量達(dá)到0.432g/L。經(jīng)放大培養(yǎng)，人參毛狀根R9923在MS液體培養(yǎng)基中，110r/min、25℃、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)速率達(dá)到7.97倍，倍增時(shí)間接近5d，生長(zhǎng)曲線類似于指數(shù)增長(zhǎng)。人參毛狀根經(jīng)4周的液體振蕩培養(yǎng)，所獲得毛狀根經(jīng)人參皂苷總含量接近于6年生的人參中皂苷含量。這說(shuō)明人工培養(yǎng)人參毛狀根是一種可行的商業(yè)化生產(chǎn)藥用成分人參皂苷的途徑。

4．傘形花耳草毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

傘形花耳草（Oldenlandia umbellata）是茜草科耳草屬草本植物，根系十分發(fā)達(dá)，在印度和斯里蘭卡名為 Chay-root。根中富含蒽醌類化合物，常用于提取染布用的染料，染出的布為暗紅紫色，經(jīng)久不褪色。

取－70℃保存的野生型發(fā)根農(nóng)桿菌菌株532，活化培養(yǎng)3d，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次，轉(zhuǎn)入YEB液體培養(yǎng)基中，25℃、250r/min條件下振蕩培養(yǎng)16h，此時(shí)菌液處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收集菌液，5000r/min離心10min，棄上清液，菌體用含3%蔗糖的液體MS培養(yǎng)基重新懸浮，調(diào)整OD600到0.4～0.6之間。

經(jīng)帶節(jié)莖段培養(yǎng)獲得的無(wú)菌苗，取培養(yǎng)5周高5～7cm的植株葉片作為預(yù)培養(yǎng)材料。剪取生長(zhǎng)15d的葉片，在葉脈處劃出3～4條傷口，接入100mL含25mL菌液的錐形瓶中，在25℃、黑暗條件下，250r/min振蕩培養(yǎng)3h。在培養(yǎng)皿中放置濾紙，用1/2MS培養(yǎng)液浸濕，取出葉片轉(zhuǎn)到濾紙上，在（25±1）℃、黑暗條件下進(jìn)行24h、48h、72h和96h共培養(yǎng)。其中共培養(yǎng)時(shí)間48h，毛狀根誘導(dǎo)率達(dá)到86.67%，與其他共培養(yǎng)時(shí)間組比較有顯著性的差異。隨著共培養(yǎng)時(shí)間（>48h）的延長(zhǎng)，每個(gè)外植體形成的毛狀根數(shù)量逐漸減少，毛狀根褐化比例增加。共培養(yǎng)過程中添加200μmol/L乙酰丁香酮（AS）可以顯著提高毛狀根誘導(dǎo)率（95%），并且增加每個(gè)外植體形成的毛狀根數(shù)量。過量添加AS，則毛狀根誘導(dǎo)率和每個(gè)外植體形成的毛狀根數(shù)量均有顯著下降。

共培養(yǎng)后的外植體用含有500mg/L氨芐青霉素的無(wú)菌水清洗，將外植體近軸面貼在1/2MS（含500mg/L氨芐青霉素、0.8%瓊脂、3%蔗糖）固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每2d轉(zhuǎn)接1次，逐漸降低抗生素濃度，從250mg/L到100mg/L。再將外植體轉(zhuǎn)入添加植物組培抑菌劑的培養(yǎng)基上清除雜菌，然后轉(zhuǎn)入無(wú)抗生素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

選取生長(zhǎng)快的2～3cm長(zhǎng)的毛狀根，單獨(dú)接種于1/2MS（含3%蔗糖）液體培養(yǎng)基中，120r/min振蕩培養(yǎng)2周。每一根系分3份轉(zhuǎn)接于3瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)分子生物學(xué)的PCR方法證實(shí)，毛狀根中存在基因rolA、rolB、rolC，在檢測(cè)的毛狀根中沒有rolD基因存在。

葉片誘導(dǎo)的毛狀根形態(tài)細(xì)長(zhǎng)、密集，多分枝，生長(zhǎng)快。選取10個(gè)毛狀根根系轉(zhuǎn)入MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，表現(xiàn)出顯著差異。L3在連續(xù)的繼代培養(yǎng)過程中，鮮重、干重和蒽醌含量表現(xiàn)穩(wěn)定，繼代培養(yǎng)中測(cè)量數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異。其中蒽醌含量在10.38～10.45mg/g DW之間變化，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因根系的遺傳穩(wěn)定性。將L3轉(zhuǎn)入MS液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)的10～15d，快速生長(zhǎng)；在隨后的培養(yǎng)過程中，蒽醌含量增加。對(duì)蒽醌類化合物中的羥基茜草素用HPLC檢測(cè)分析，傘形花耳草毛狀根和野生傘形花耳草根中均含有羥基茜草素。其中野生傘形花耳草根中羥基茜草素含量為6.08mg/g DW；毛狀根中羥基茜草素含量21.83mg/g DW，比野生的高出260%。

五、轉(zhuǎn)基因植株的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

1．玉米轉(zhuǎn)基因體系的建立

玉米既可食用也可以作為工業(yè)原料。中國(guó)是世界上第二大玉米生產(chǎn)國(guó)，在中國(guó)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中具有重要的戰(zhàn)略地位，其遺傳轉(zhuǎn)化研究具有明顯的理論和應(yīng)用意義。

取人工授粉后9～12d的多個(gè)玉米品系的雌穗，4℃冰箱存貯3～4d，室內(nèi)去苞葉，用70%乙醇擦拭表面，再用0.1%HgCl2浸泡5min，無(wú)菌水沖洗4～5次，切去3/5籽粒，取同一部位長(zhǎng)度為1～2mm的幼胚，盾片朝上分別接種于11個(gè)因素比較的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。15d繼代1次，溫度27℃，光照12h。結(jié)果表明：基因型對(duì)玉米胚性愈傷誘導(dǎo)具有決定作用，即使改進(jìn)培養(yǎng)條件也難使一些玉米品種誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。6-BA、培養(yǎng)基、AgNO3、2，4-D、ABA對(duì)胚性愈傷誘導(dǎo)的影響達(dá)到顯著水平。其中生長(zhǎng)素維持在2mg/L，細(xì)胞分裂素保持在低水平，有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)；ABA以2mg/L的濃度隔代補(bǔ)充，愈傷組織生長(zhǎng)快、易碎、分散性好、顏色鮮黃，有利于胚性愈傷組織的增殖、繼代、保持及后續(xù)分化。玉米品種綜31在改良培養(yǎng)基（MB＋2，4-D 2mg/L＋KT 0.2mg/L＋ZT 0.5mg/L＋6-BA 1mg/L＋ABA 2mg/L＋L-谷氨酰胺50mg/L＋AgNO3 5mg/L）上愈傷組織誘導(dǎo)效果好；玉米品種黃早4 在改良培養(yǎng)基（MB＋2，4-D 1.5mg/L＋NAA 0.2mg/L＋KT 0.5mg/L＋ZT 0.2mg/L＋ABA 2mg/L＋甘露醇 5mg/L＋L-谷氨酰胺300mg/L）上愈傷組織誘導(dǎo)效果好（ABA每間隔1代添加1次）。

黃早4、綜31、金黃96B和GY237的胚性愈傷組織接種于測(cè)試培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度 25℃，光照12h。黃早4和綜31的最佳胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基分別是改良NB＋6-BA 2mg/L＋KT 0.5mg/L＋ZT 0.5mg/L＋ABA 0.1mg/L＋AgNO3 1mg/L和改良 MB＋2，4-D 0.1mg/L＋KT 0.1mg/L＋6-BA 2mg/L＋ABA 0.5mg/L＋AgNO3 5mg/L。

幼胚用預(yù)先加入AS的侵染液浸泡處理，用無(wú)菌吸水紙將外植體表面菌液吸干后放入共培養(yǎng)基中（含有AS及500mg/L乙磺酸），暗培養(yǎng)3d，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基（含25mg/L潮霉素及500mg/L頭孢噻肟鈉），2周繼代1次，共4次。然后黃早4和綜31愈傷組織分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的分化培養(yǎng)基上（含300mg/L頭孢噻肟鈉及潮霉素由20mg/L漸降到10mg/L），獲得轉(zhuǎn)基因植株。

添加50μmol/L AS能啟動(dòng)T-DNA的轉(zhuǎn)移，黃早4在150～170μmol/L、綜31在170～190μmol/L達(dá)到最高的轉(zhuǎn)化率。培養(yǎng)溫度18℃有低水平的轉(zhuǎn)化，24～25℃時(shí)達(dá)到最大值，而在26℃后大幅度下降。在農(nóng)桿菌菌液濃度和浸泡時(shí)間方面，OD值為0.7時(shí)浸泡15min轉(zhuǎn)化率最高。以抗性愈傷率為指標(biāo)，黃早4和綜31轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到48.6%和46.2%。

2．水稻轉(zhuǎn)基因植株的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

經(jīng)過近30年的探索，水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得了巨大的進(jìn)步。由于水稻品種間差異較大，具有遺傳的多樣性，轉(zhuǎn)化效率對(duì)品種的基因型依賴性較強(qiáng)。

成熟的不同品系種子去除硬殼，用70%乙醇浸泡2 min，0.1% HgCl2溶液浸泡30 min，無(wú)菌水漂洗3次，然后在含有2.0mg/L 2，4-D的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)物在暗處于26℃培養(yǎng)2周，然后切下誘導(dǎo)產(chǎn)生的盾片愈傷組織，選擇致密的愈傷組織顆粒，用于轉(zhuǎn)化。帶有Xa21基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)24h至A595為0.8。離心收集農(nóng)桿菌細(xì)胞，用AAM培養(yǎng)基洗滌1次，再懸浮在AAM中至A595為0.5（約109細(xì)胞/mL）。

將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織顆粒放入AAM農(nóng)桿菌懸液中浸泡5min，然后放置于滅菌紙上，除去過多的菌液。轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基（MS＋10μmol/L乙酰丁香酮）上于26℃暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2～3d。在共培養(yǎng)后，用無(wú)菌水徹底洗滌愈傷組織幾次，然后在含噻孢霉素500mg/L的無(wú)菌水中120r/min振蕩洗滌2h，洗滌后的愈傷組織鋪在選擇培養(yǎng)基（MS＋2mg/L 2，4-D＋300-500mg/L噻孢霉素＋30～50mg/L潮霉素）上培養(yǎng)3周。然后轉(zhuǎn)移到新的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)2～3周。經(jīng)兩次選擇培養(yǎng)后生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織在預(yù)分化培養(yǎng)基（MS＋5mg/L ABA＋2mg/L 6-BA＋2mg/L NAA＋50mg/L潮霉素）上26℃暗培養(yǎng)2～3周，然后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS＋3mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA＋1.0mg/L IAA＋2.5mg/L KT＋50mg/L潮霉素）上，持續(xù)光照下26℃培養(yǎng)2～3周至分化出苗，當(dāng)再生苗長(zhǎng)至10cm高時(shí)移植到土壤中，在溫室中長(zhǎng)至成熟。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化Xa21轉(zhuǎn)入明恢63、珍汕97B、鹽恢559、太湖粳6和中花11號(hào)5個(gè)水稻品種，經(jīng)PCR檢測(cè)和Southern雜交確定轉(zhuǎn)基因的真實(shí)性，經(jīng)抗性篩選獲得粳稻和秈稻的轉(zhuǎn)基因株系。測(cè)試水稻品種轉(zhuǎn)化率在3.6%～10.5%之間，表現(xiàn)出秈稻轉(zhuǎn)化率高于粳稻。轉(zhuǎn)基因植株抗性分析表明，所有分子檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出對(duì)白葉枯病的高度抗性。轉(zhuǎn)基因株系自交T1代經(jīng)PCR分析和接種分析揭示的抗感分離比均為3∶1。田間試驗(yàn)還表明，轉(zhuǎn)基因植株及其后代的其他性狀均未見可察覺的變異。

3．非洲菊轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)與境良

非洲菊（Gerbera hybrida）是研究花瓣形態(tài)建成調(diào)控機(jī)制的理想材料，在國(guó)際上已被作為研究復(fù)雜花序的模式植物。將－80℃保存的發(fā)根農(nóng)桿菌K599、R1000和ATCC15834在含50mg/L鏈霉素（streptomycin，Str）的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于含50mg/L Str的液體LB培養(yǎng)基中，于28℃、230～250r/min培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6。收集菌液，4500g離心10 min，含2%乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）的1/2MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD600為0.5～0.6，備用，標(biāo)記為侵染液。

將繼代21～28d的無(wú)菌苗葉片的葉基部、葉頂部和葉柄，用解剖刀劃出創(chuàng)傷口，轉(zhuǎn)至MS固體培養(yǎng)基（pH 6.8）上，25℃黑暗預(yù)培養(yǎng)2d，轉(zhuǎn)入侵染液中，28℃、100r/min振蕩侵染5～30min。吸干外植體表面菌液并移至MS固體培養(yǎng)基（pH 6.8）上，黑暗共培養(yǎng)0～4d。經(jīng)過共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)入含250mg/L頭孢氨芐（cefalexin，Cef）的無(wú)菌水中10 min，轉(zhuǎn)入含250mg/L Cef的MS固體培養(yǎng)基（pH 6.8）上，25℃、長(zhǎng)日照條件下（16h/d）誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生。產(chǎn)生的毛狀根轉(zhuǎn)移至不含植物生長(zhǎng)物質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)。

研究發(fā)現(xiàn)：3個(gè)發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對(duì)非洲菊品種LL葉片進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)，K599菌株毛狀根誘導(dǎo)率最高（80.27%），ATCC15834最低（0.71%）。因此，后續(xù)研究選擇發(fā)根農(nóng)桿菌K599進(jìn)行。選用4個(gè)品種的非洲菊進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)，品種LL毛狀根誘導(dǎo)率最高（81.14%），與其他3個(gè)品種相比存在明顯優(yōu)勢(shì)。非洲菊葉片葉基部的毛狀根誘導(dǎo)效率最高（86.7%），葉基部培養(yǎng)18d即可見到白色毛根，葉柄26d才可見到白色毛根。最適共培養(yǎng)時(shí)間為2d。用帶有表達(dá)載體35S：：AtHBI1-GUS的發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液侵染非洲菊葉基部，獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根。經(jīng)GUS顯色表明，成功轉(zhuǎn)化35S：：AtHBI1-GUS的毛狀根出現(xiàn)明顯的深藍(lán)色。轉(zhuǎn)入AtHBI1的毛狀根生長(zhǎng)快，出現(xiàn)較分枝多。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)入HBI1的毛狀根生長(zhǎng)速率高9%。

4．黃瓜轉(zhuǎn)基因植株的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

黃瓜在生長(zhǎng)過程中極易遭受各種病蟲害及不利環(huán)境的影響，使黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)大大降低。由于種內(nèi)資源有限，常規(guī)育種出現(xiàn)瓶頸。

取飽滿的“新泰密刺”黃瓜種子預(yù)浸泡2～3h，剝除種皮后用75%乙醇消毒30s，再用6.5%次氯酸鈉消毒15 min，用無(wú)菌水沖洗5次，接種在MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)。培養(yǎng)1～2d，將子葉部分橫切成4塊，獲得子葉外植體。如果以子葉節(jié)作外植體時(shí)要待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，約4～5d后子葉呈直立狀態(tài)時(shí)切取，去除1/2子葉僅留2mm的下胚軸，并在預(yù)培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L AgNO3）上培養(yǎng)2d。

選取含有目的基因載體的農(nóng)桿菌單菌落，接種于50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌，250r/min、28℃過夜培養(yǎng)。當(dāng)OD在0.6～0.8時(shí)收集菌液，10000g離心8～10min，棄上清液，用等體積MS液體培養(yǎng)基重懸菌體。菌液侵染前添加0.725mg/L AS。

黃瓜子葉外植體于農(nóng)桿菌懸濁液中侵染15～20min，用無(wú)菌濾紙吸干，接種在培養(yǎng)基（MS＋2.0mg/L 6-BA＋1.0mg/L ABA＋1.45mg/L AS）上共培養(yǎng)，25℃暗培養(yǎng)2～3d。轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基（MS＋2.0mg/L 6-BA＋1.0mg/L ABA＋10mg/L Hyg＋400mg/L Cef）對(duì)子葉進(jìn)行篩選培養(yǎng)3周。此過程可形成具有抗性的再生芽，再生頻率為76.5%。將具有抗性的再生芽轉(zhuǎn)入含25mg/L Hyg的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，抗性植株率降低到8.8%。經(jīng)篩選后保持綠色的再生植株可轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基（MS＋1mg/L GA＋400mg/L Cef）中培養(yǎng)，2～3周后可發(fā)育為完整植株。對(duì)子葉再生植株進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，平均陽(yáng)性率為27.8%。將PCR陽(yáng)性的子葉再生植株進(jìn)一步經(jīng)Southern雜交檢測(cè)，平均陽(yáng)性率為13.9%，同時(shí)通過雜交條帶數(shù)可看出目的基因均以單拷貝形式插入基因組中。

子葉節(jié)外植體在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d，在農(nóng)桿菌懸濁液中侵染15～20min，取出后吸干外植體表面的菌液，接種于共培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L AgNO3＋1.45mg/L AS）上，25℃暗培養(yǎng)2～3d。轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L AgNO3＋7mg/L Hyg＋400mg/L Cef）上篩選2周，可見發(fā)育出的小芽點(diǎn)，再生頻率為51.8%。將小芽點(diǎn)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基（MS＋0.5mg/L 6-BA＋2.0mg/L AgNO3＋15mg/L Hyg＋400mg/L Cef）上對(duì)子葉節(jié)進(jìn)行高濃度篩選1周，可發(fā)育為再生芽，抗性植株率降低到29.6%。將保持綠色的再生抗性芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1～2周后可獲得完整植株。對(duì)子葉節(jié)外植體再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，平均陽(yáng)性率為19.3%。將PCR陽(yáng)性的子葉節(jié)再生植株進(jìn)一步采用Southern雜交檢測(cè)，平均陽(yáng)性率為6.9%。

5．馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

馬鈴薯（Solanum tuberosum L．）為同源四倍體，具有高度雜合性，常導(dǎo)致自交不親和和雄性不育，從而降低了用常規(guī)育種方法進(jìn)行馬鈴薯改良的效率。目前，人們通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入外源基因來(lái)實(shí)現(xiàn)馬鈴薯的品質(zhì)改良。

根據(jù)AlNHX1基因（Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，PCR擴(kuò)增AlNHX1基因，并將AlNHX1基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBI121。將構(gòu)建好的質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，并將菌液涂布于含有卡那霉素和利福平的YEB培養(yǎng)基上，挑選抗性菌落并經(jīng)PCR篩選出陽(yáng)性工程菌。

將馬鈴薯“克新18號(hào)”經(jīng)外植體消毒后切成1～2mm薄片，于無(wú)菌濾紙上吸水干燥后置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋2mg/L ZT＋0.1mg/L NAA＋2mg/L 2，4-D＋0.3g/L酪蛋白水解物＋2.88g/L L-脯氨酸＋0.1g/L肌醇＋30g/L蔗糖）上，28℃預(yù)培養(yǎng)。約10d后馬鈴薯表面出現(xiàn)小顆粒愈傷組織。將馬鈴薯愈傷組織浸入含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液（OD600＝0.6）中，振蕩搖勻，5min后倒掉菌液。將馬鈴薯愈傷組織轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基（MS＋2mg/L ZT＋0.1mg/L NAA＋0.3g/L酪蛋白水解物＋0.02g/L AS＋0.1g/L肌醇＋30g/L蔗糖）上，28℃暗培養(yǎng)2d。然后將其用無(wú)菌水和MS液體培養(yǎng)基各清洗3次，接種于篩選培養(yǎng)基（MS＋2mg/L ZT＋0.3g/L酪蛋白水解物＋2.88g/L L-脯氨酸＋0.1g/L肌醇＋0.02g/L G418＋0.4g/L頭孢霉素＋30g/L蔗糖）上，28℃培養(yǎng)10d，轉(zhuǎn)到新的篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出綠色抗性愈傷顆粒。將篩選后的馬鈴薯愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS＋0.1mg/L NAA＋2mg/L KT＋2g/L酪蛋白＋0.1g/L肌醇＋30g/L山梨醇＋0.02g/L G418＋0.4g/L頭孢霉素＋30g/L蔗糖）上，28℃光照培養(yǎng)，當(dāng)抗性芽生長(zhǎng)至1cm左右時(shí)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS＋0.1g/L肌醇＋0.02g/L頭孢霉素＋30g/L蔗糖）上誘導(dǎo)生根，當(dāng)植株長(zhǎng)到6～8cm時(shí)將其在溫室內(nèi)移栽入土。

轉(zhuǎn)基因馬鈴薯在0.7% NaCl鹽脅迫條件下植株仍能正常生長(zhǎng)，耐鹽性得到提高。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的Na＋、K＋含量及Na＋/K＋的比值均高于野生型馬鈴薯，表明AlNHX1基因在馬鈴薯中表達(dá)可以使植物細(xì)胞維持較高的Na＋/K＋，使馬鈴薯的耐鹽性得到提高。

6．大豆轉(zhuǎn)基因植株的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

1988年轉(zhuǎn)基因大豆植株獲得成功，但目前轉(zhuǎn)化的效率還比較低。成熟大豆“南農(nóng)-34”種子經(jīng)常規(guī)滅菌，接入培養(yǎng)基[MSB5（MS無(wú)機(jī)鹽和維生素B5）＋6-BA 0.4mg/L]中萌發(fā)5～6d。用切除部分下胚軸，留3～5mm，去除1/3的子葉，在兩片子葉之間縱切。將切好的子葉節(jié)浸泡于含有重組Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的農(nóng)桿菌菌液中，于25℃、180r/min振蕩培養(yǎng)30min，吸干子葉節(jié)上的菌液，接入無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中黑暗條件下培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)接至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MSB5＋1.5mg/L 6-BA＋50mg/L Kan＋250mg/L Cef）中光照培養(yǎng)，約1周后外植體開始出現(xiàn)鮮綠的芽點(diǎn)，繼代培養(yǎng)逐漸長(zhǎng)成叢生芽，出芽數(shù)4～8個(gè)，約4周后，苗高可達(dá)7～10cm，且長(zhǎng)勢(shì)良好。選取帶有叢生芽的外植體轉(zhuǎn)接至根誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1/2MSB5＋1.0mg/L IBA＋250mg/L Cef）中，7～10d后開始形成新生根系，3周后主根粗壯，側(cè)根濃密。選取根長(zhǎng)7～10cm的再生植株，經(jīng)煉苗后移栽至溫室內(nèi)盆栽培養(yǎng)，獲得形態(tài)特征正常的再生抗性植株。

將含有pBI121-LW重組質(zhì)粒的EHA105、C58和AGL1侵染的抗性苗，切下部分組織進(jìn)行GUS染色，發(fā)現(xiàn)EHA105侵染的外植體來(lái)源的組織中58%呈現(xiàn)藍(lán)色，而C58和AGL1侵染的外植體來(lái)源的組織沒有出現(xiàn)藍(lán)色。表明EHA105的侵染大豆和整合外源基因的能力強(qiáng)于C58和AGL1；也說(shuō)明質(zhì)粒載體中攜帶的GUS基因已得到表達(dá)。在抗性植株中58%檢測(cè)到LW-MRP基因，對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的核酸提取產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致，說(shuō)明目的基因已整合到大豆基因組中。

大豆抗性植株葉片采用自動(dòng)氨基酸分析儀檢測(cè)甲硫氨酸含量，轉(zhuǎn)基因大豆植株的甲硫氨酸含量有不同程度提高，甲硫氨酸含量提高最大植株達(dá)到51.11%，甲硫氨酸含量提高的平均值達(dá)到27.81%。