1.3 植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)及有關(guān)現(xiàn)象

1.3.1 細(xì)胞全能性學(xué)說

組織培養(yǎng)技術(shù)得以建立的最重要的依據(jù)是植物細(xì)胞全能性（totipotency）理論。植物細(xì)胞全能性的概念是指植物機(jī)體的每個(gè)生活細(xì)胞具有相同的遺傳組成，在適當(dāng)條件下都能夠形成具有繁殖健全下一代的完整植株的能力[39]。細(xì)胞全能性的最高表現(xiàn)是受精卵（或稱合子），在組織培養(yǎng)物中形成芽（它能產(chǎn)生完整植株）也是植物細(xì)胞全能性的典型表現(xiàn)。細(xì)胞、組織或器官離體培養(yǎng)以后不同程度地脫離了多細(xì)胞機(jī)體中細(xì)胞的相互制約，表現(xiàn)出不同程度的全能性。

1.3.2 分化和脫分化

所謂分化（differentiation）指?jìng)€(gè)體發(fā)生中由受精卵產(chǎn)生的、具有相同遺傳組成的細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和生理功能諸方面產(chǎn)生差異，形成不同類型特化細(xì)胞的過程[40]。從分子生物學(xué)觀點(diǎn)看，細(xì)胞分化的本質(zhì)變化是發(fā)生差別基因表達(dá)、合成專一性蛋白質(zhì)，細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的遺傳表型[41]。分化是相對(duì)的，多細(xì)胞植物體內(nèi)各細(xì)胞分化程度不同。根據(jù)細(xì)胞特化程度和它們的分裂能力可以將植物體的細(xì)胞分為三類：第一類如莖尖、根尖和形成層細(xì)胞，它們始終保持旺盛的分生能力，從一個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)入另一個(gè)周期；第二類是高度特化的細(xì)胞，如篩管、導(dǎo)管和氣孔器的保衛(wèi)細(xì)胞，永遠(yuǎn)失去分生能力；第三類如表皮細(xì)胞和各種薄壁組織細(xì)胞，在通常情況下不進(jìn)行DNA合成和細(xì)胞分裂，但在受到適當(dāng)?shù)拇碳ず罂梢灾匦麻_始DNA合成和細(xì)胞分裂，稱為G0期細(xì)胞[42]。

脫分化（dedifferentiation）即分化的逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞失去已有的分化特征，恢復(fù)到相對(duì)不分化的分生組織狀態(tài)。脫分化也應(yīng)當(dāng)是在基因的選擇性表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的一系列生理、生化變化，使分化細(xì)胞變成胚性細(xì)胞的過程。植物學(xué)上關(guān)于脫分化的概念有不同的理解。從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)上看，已經(jīng)分化的細(xì)胞通過一系列的細(xì)胞分裂和細(xì)胞內(nèi)部的改組逐漸失去各種分化的特征，因而認(rèn)為脫分化是漸進(jìn)的、分階段的和較長(zhǎng)的過程。另一種觀點(diǎn)則從細(xì)胞周期角度來考察脫分化問題：已經(jīng)分化的、脫離了細(xì)胞周期的G0期的細(xì)胞在某種刺激下重新回到細(xì)胞周期的G1期，開始了新的DNA合成時(shí)，即完成了脫分化；脫分化完成以后才進(jìn)行細(xì)胞分裂，細(xì)胞分裂是脫分化的結(jié)果[42][43]，因此他們認(rèn)為脫分化過程是相當(dāng)迅速的。

再分化（redifferentiation）即經(jīng)過脫分化的細(xì)胞、組織重新獲得不同分化程度的特征。組織培養(yǎng)工作者一般都認(rèn)為愈傷組織是脫分化的產(chǎn)物。一般對(duì)脫分化理解得過于籠統(tǒng)。但是在組織培養(yǎng)實(shí)踐中可以看到，有的愈傷組織具有產(chǎn)生該種植物各種類型細(xì)胞、組織和器官甚至植物體的全部潛能，這是比較徹底的脫分化，差不多恢復(fù)到受精卵的狀態(tài)。但是也常常看到有些在不同種類和不同濃度外源激素調(diào)控下既能分化出生殖器官，又能再生營(yíng)養(yǎng)芽的情況[44]，說明這類愈傷組織或外植體細(xì)胞只是部分地脫分化，只部分地恢復(fù)了細(xì)胞的全能性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞、組織和器官的再分化。從這里可以看出，再分化的產(chǎn)物可以反襯出脫分化也是相對(duì)的、分階段的，而非一次完成的。

李正理、崔克明等通過樹木剝皮后形成層活動(dòng)和新皮再生的長(zhǎng)期研究，對(duì)分化、脫分化和再分化關(guān)系有了更深一層的認(rèn)識(shí)。崔克明[45]結(jié)合自己的研究和組織培養(yǎng)的新成就（如陸文樑等的工作）提出植物細(xì)胞分化階段性的假說，其內(nèi)容可概括為：細(xì)胞分化過程分為許多相繼有序、不可逾越的階段；分化過程中有一個(gè)臨界期，分化到達(dá)臨界期之前是可逆的，可以脫分化或轉(zhuǎn)分化（為其他結(jié)構(gòu)），過了臨界期就成為不可逆（即不能脫分化）了；脫分化也有階段性，可以完全脫分化，也可以不完全脫分化而停止于某一階段；細(xì)胞分化的最后階段是細(xì)胞編程死亡。

1.3.3 細(xì)胞決定與細(xì)胞分化

決定（determination）一詞來自動(dòng)物胚胎學(xué)，指胚胎某一區(qū)域的細(xì)胞獲得向某一特定方向分化而排除其他可能性的預(yù)定發(fā)育狀態(tài)。

先看一看植物細(xì)胞的穩(wěn)定變化和記憶效應(yīng)：一種蕨類的紫萁屬植物Osmunda cinnamonea的孢子體，其幼小的葉原基離體培養(yǎng)能產(chǎn)生完整的莖軸系統(tǒng)（shoot）；隨著葉原基年齡的增長(zhǎng)，莖軸系統(tǒng)的發(fā)生率減少，葉子的發(fā)生率增加。這說明早期的葉原基具有與莖分生組織相同的發(fā)育潛能，后來葉原基發(fā)生了穩(wěn)定的變化，它的發(fā)育潛能局限于形成葉[46]。另一種南洋杉屬植物Araucaria excelsa具有直立的主干和塔狀的樹形，其上長(zhǎng)出分層排列的一級(jí)分支，一級(jí)分支上生出水平伸展的二級(jí)分支。V?chting[47]在扦插試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，主干的莖尖生長(zhǎng)成正常的完整植株；一級(jí)分支頂端的插條能夠分支，但不能直立生長(zhǎng)；二級(jí)分支頂端的插條不能分支，而長(zhǎng)成線狀伸展的枝條。來源于花器官的外植體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下易于分化花芽[44]。這些實(shí)驗(yàn)展示了植物的記憶效應(yīng)，證實(shí)了這些枝條的分生組織的發(fā)育潛能受到了限制，而且這種決定的狀態(tài)在分裂產(chǎn)生的細(xì)胞群體中持續(xù)下去[48]。

按照細(xì)胞分化的決定學(xué)說，植物細(xì)胞的分化分為兩個(gè)階段：第一階段為細(xì)胞分化的（預(yù)）決定階段，包括自細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)（competence）開始的誘導(dǎo)（induction）過程和達(dá)到確定細(xì)胞命運(yùn)的決定狀態(tài)。在這一階段，決定了發(fā)育命運(yùn)的細(xì)胞并不帶有任何明顯的標(biāo)志而被直接觀察到，只有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作（例如離體培養(yǎng)）[49]時(shí)或者借助特殊的細(xì)胞標(biāo)記方法[50]才能覺察。所謂感受態(tài)，即細(xì)胞的反應(yīng)狀態(tài)，具有對(duì)特定刺激產(chǎn)生反應(yīng)的能力的狀態(tài)。植物細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，才能感受特定的刺激。在離體培養(yǎng)中，外植體的細(xì)胞經(jīng)過脫分化，進(jìn)入感受態(tài)，再經(jīng)過誘導(dǎo)，進(jìn)入決定狀態(tài)，確定細(xì)胞分化的命運(yùn)[48][49]。細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)和達(dá)到?jīng)Q定狀態(tài)所需的時(shí)間（即脫分化過程）隨細(xì)胞的基因型和細(xì)胞來源的不同而有差異，它是可以通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)定量測(cè)定的[49]。第二階段是表達(dá)階段，決定了命運(yùn)的細(xì)胞發(fā)生一系列變化，形態(tài)發(fā)生的潛能得以表達(dá)。

已如前述細(xì)胞的決定狀態(tài)是穩(wěn)定的，但在一定條件下并不是不可逆的。在適當(dāng)?shù)拇碳は拢芟拗频陌l(fā)育潛能可以改變[48]。例如，一種仙人掌屬植物Opuntia polycantha的莖端分生組織培養(yǎng)于含細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中形成葉，培養(yǎng)于含赤霉素的培養(yǎng)基中則形成刺。洋常春藤（Hedera helix）的幼株和成年株有不同的形態(tài)和生長(zhǎng)習(xí)性。在嫁接實(shí)驗(yàn)中，無論用幼株或成年株作接穗或砧木，接穗長(zhǎng)出的枝條總是與接穗相同。但成年接穗用赤霉素處理后轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的幼年?duì)顟B(tài)。因此，發(fā)育狀態(tài)的轉(zhuǎn)變雖然非常穩(wěn)定，但并非恒久不變的。決定狀態(tài)的穩(wěn)定性既取決于培養(yǎng)物本身的特性，也與培養(yǎng)條件密切相關(guān)。植物培養(yǎng)物易受外界條件的影響，常常失去原有的決定狀態(tài)或分化特征而表現(xiàn)出高度的可塑性[50]。這可能是植物學(xué)工作者常常忽視“決定”現(xiàn)象的客觀原因。

1.3.4 植物器官克隆及相應(yīng)的假說和設(shè)想

在1.2.3小節(jié)中已經(jīng)提及陸文樑實(shí)驗(yàn)室的成就。他們通過嚴(yán)格掌握分離外植體的器官在供體植株中分化的時(shí)期，準(zhǔn)確控制外源激素的濃度，在一定時(shí)間之內(nèi)控制外植體不斷再生被子植物的各種器官，即所說的“器官克隆”[51][52]，并從中得到了許多規(guī)律性的認(rèn)識(shí)，提出了一些試圖闡明“器官克隆”的假說，現(xiàn)分別介紹如下：

1．細(xì)胞全能性的完全表達(dá)和部分表達(dá)假說

通過離體培養(yǎng)在外植體上不斷再生某種器官、器官內(nèi)分化特定的組織或細(xì)胞。這種情況與外植體上再生植株既有共同點(diǎn)又不完全相同。共同點(diǎn)是二者均為特定外因的誘導(dǎo)下細(xì)胞潛能的表達(dá)；不同點(diǎn)在于再生完整植株是細(xì)胞全能性的完全表達(dá)，再生器官及器官中特定組織或特定細(xì)胞則屬于“細(xì)胞全能性的部分表達(dá)”。

2．細(xì)胞的發(fā)育和逆發(fā)育的設(shè)想

①受精卵具有最大的發(fā)育潛能，由受精卵發(fā)育成導(dǎo)致器官發(fā)生的主胚性細(xì)胞團(tuán)和導(dǎo)致器官中特定組織和特定細(xì)胞分化的次級(jí)胚性細(xì)胞團(tuán)。決定器官發(fā)生的各類器官特征基因只在主胚性細(xì)胞中按次序激活，決定各種組織和細(xì)胞發(fā)生的基因只在次級(jí)胚性細(xì)胞中按次序激活。

②主胚性細(xì)胞具有發(fā)育和逆發(fā)育的特性（圖1-1）。主胚性細(xì)胞中基因按程序表達(dá)的過程是發(fā)育，從正在表達(dá)的時(shí)期退回到以前已經(jīng)表達(dá)過的時(shí)期是逆發(fā)育，在某個(gè)發(fā)育或逆發(fā)育年齡段必定分化與這個(gè)年齡段相應(yīng)的器官。

③在植物個(gè)體發(fā)育中，當(dāng)卵受精轉(zhuǎn)變成主胚性細(xì)胞后表現(xiàn)出發(fā)育的特性，在發(fā)育的不同時(shí)期必定分化出相應(yīng)的器官。

④在離體培養(yǎng)中不同濃度外源激素的作用下，外植體細(xì)胞脫分化形成的主胚性細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的逆發(fā)育的特性，分別退回到它們以前的各個(gè)年齡段，并在這些年齡段分別進(jìn)行器官再生，分化出這個(gè)年齡段應(yīng)該分化的器官。

⑤細(xì)胞逆發(fā)育必定與細(xì)胞脫分化同時(shí)發(fā)生。

3．生長(zhǎng)素濃度對(duì)離體器官按次序發(fā)生的影響及其轉(zhuǎn)換開關(guān)的作用假說

（1）從風(fēng)信子花被片到果實(shí)狀結(jié)構(gòu)的再生

風(fēng)信子花芽外植體培養(yǎng)在附加2mg/L 6-BA和0.1mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)直接形成花芽原基后，若在這種培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)，則再生花芽中不斷地分化花被片，但不會(huì)分化雄蕊和雌蕊；若轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)素濃度較低的培養(yǎng)基上，再生花芽的生長(zhǎng)點(diǎn)上就不再形成新的花被片，轉(zhuǎn)而形成雄蕊；若在這樣的培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)，則雄蕊的數(shù)量不斷增加而不會(huì)分化雌蕊；若在雄蕊分化后進(jìn)一步降低生長(zhǎng)素濃度，則有利于胚珠的發(fā)生。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，這種規(guī)律性一直延伸到大孢子母細(xì)胞形成。胚珠原基分化后若不進(jìn)一步降低培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素濃度，則大孢子母細(xì)胞不能分化。于是陸文樑等便形成了花芽主胚性細(xì)胞團(tuán)中生長(zhǎng)素濃度的梯度降低在各輪花器官依次發(fā)生中起“轉(zhuǎn)換開關(guān)”的作用的設(shè)想。有關(guān)該設(shè)想的主要論點(diǎn)簡(jiǎn)述如下（若要更詳盡地了解，可參考陸文樑的文章[51][52]）：

①花芽主胚性細(xì)胞團(tuán)通過生長(zhǎng)素濃度來控制各輪花器官的數(shù)目。

②不同花器官的分化需要不同濃度的生長(zhǎng)素。

③花器官的分化從外輪到內(nèi)輪所需要的生長(zhǎng)素濃度逐漸降低。

④在這種生長(zhǎng)素濃度梯度變化中各級(jí)濃度的變化起器官分化的“轉(zhuǎn)換開關(guān)”的作用。在器官按次序發(fā)生中，起著抑制上一個(gè)器官的特征基因表達(dá)，同時(shí)又激活下一個(gè)器官的特征基因表達(dá)的作用。

⑤花芽中四輪花器官分化的次序不因外源激素的變化而改變。

（2）從營(yíng)養(yǎng)芽到花芽再生

以花葉千年木為材料誘導(dǎo)愈傷組織分別再生幼齡態(tài)營(yíng)養(yǎng)芽、成年態(tài)營(yíng)養(yǎng)芽、花序、花序分支、花芽和花被片，所需的生長(zhǎng)素濃度逐漸升高，見圖1-2。

（3）綜合以上（1）和（2）可以看出，以花芽分化為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，對(duì)于植株分化花芽以前的器官來說，越是早期的器官，再生需要的生長(zhǎng)素濃度越低；對(duì)于植株分化花芽原基以后形成的器官來說，越是晚期的器官，再生需要的生長(zhǎng)素濃度越低，見圖1-3。由于離體培養(yǎng)的外植體脫離了供體植株，它的發(fā)育與再生是自律的，不受整體植株的調(diào)控。觀察外源激素的濃度變化對(duì)器官分化的影響，就能夠比較容易地了解激素對(duì)器官分化的控制。

1.3.5 組織培養(yǎng)中發(fā)生的變異

按照細(xì)胞全能性學(xué)說，每個(gè)生活的植物細(xì)胞都具有相同的遺傳信息，由它們得到的再生植株應(yīng)當(dāng)顯示完全相同的遺傳特性。但是通過離體培養(yǎng)，由愈傷組織得到的再生植株在形態(tài)和生化特征、特化的功能、成熟期和器官發(fā)生的潛能等方面常常出現(xiàn)變異。有兩類不同傳遞特點(diǎn)的變異：表觀遺傳變化和體細(xì)胞無性系變異。

1．表觀遺傳變化

表觀遺傳變化（epigenetic change）又稱為后生變化。組織培養(yǎng)中常常看到有些表現(xiàn)型可以在愈傷組織的繼代和克隆繁殖中傳遞，但是經(jīng)過有性生殖后往往就消失了。現(xiàn)舉一類關(guān)于“馴化（habituation）”現(xiàn)象的例子。1942年，Gautheret在菊芋（Helianthus tuberosus）塊莖切片離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，隨著繼代培養(yǎng)的進(jìn)行，細(xì)胞發(fā)生了性質(zhì)上的變化。初次培養(yǎng)時(shí)，菊芋組織在含10-5mol/L IAA的培養(yǎng)基中達(dá)到最大的生長(zhǎng)量，繼代培養(yǎng)一次達(dá)到最大的生長(zhǎng)量對(duì)IAA濃度要求降低為10-6mol/L，繼代二次又降至10-7mol/L。他又以胡蘿卜薄壁組織為材料，初次培養(yǎng)時(shí)，IAA濃度達(dá)到10-6mol/L才能得到最大的生長(zhǎng)量，繼代多次以后在不含IAA的培養(yǎng)基上也能達(dá)到同樣的生長(zhǎng)量。在葡萄的形成層組織的離體培養(yǎng)中也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象。這種隨著繼代培養(yǎng)的進(jìn)行對(duì)培養(yǎng)基中所含物質(zhì)含量要求的降低，直至變成生長(zhǎng)素自生的特性變化可以隨著細(xì)胞系的繁殖傳遞下去的現(xiàn)象，稱為馴化。

馴化現(xiàn)象也表現(xiàn)在愈傷組織對(duì)細(xì)胞分裂素的需求[39]上。煙草葉組織離體培養(yǎng)中只有提供外源細(xì)胞分裂素才能連續(xù)地生長(zhǎng)；同一煙草植株的莖皮層組織在相同的培養(yǎng)條件下卻具有細(xì)胞分裂素自生能力。這兩種組織的細(xì)胞克隆后仍保持各自的表現(xiàn)型，說明這兩種狀態(tài)可通過細(xì)胞遺傳。然而由葉細(xì)胞和莖皮層細(xì)胞克隆得到的再生植株的葉和莖皮層組織顯示出與由種子產(chǎn)生的植株的同類組織相同的表現(xiàn)型。因此，Nanney提出存在兩個(gè)遺傳系統(tǒng)的假說[53]：一個(gè)遺傳系統(tǒng)與機(jī)體有性世代之間發(fā)育潛能的傳遞有關(guān)；另一個(gè)表觀遺傳系統(tǒng)或后生（即發(fā)育的）系統(tǒng)，與基因表達(dá)方式（而不是基因組的永久性變化）的體細(xì)胞傳遞有關(guān)。有關(guān)馴化的機(jī)理至今還不是很清楚。

2．體細(xì)胞無性系變異

按照細(xì)胞全能性理論，同一植株的各個(gè)細(xì)胞再生出來的植株應(yīng)當(dāng)具有相同的遺傳特性。不過與有性生殖的后代相比，同一無性系各植株之間總體上的確比較整齊一致。但是，通過愈傷組織再生的植株也常常出現(xiàn)各種變異。Sacristan和Melchers于1969年首先報(bào)道了由長(zhǎng)期培養(yǎng)的煙草愈傷組織再生的植株出現(xiàn)的各種形態(tài)學(xué)變異。后來Heinz和Mee分別于1969和1971年在甘蔗的再生植株中觀察到高頻率的變異。Larkin和Scowcroft在評(píng)述中將這種現(xiàn)象稱為體細(xì)胞無性系變異（somaclonal variation）[54]。

早期的研究著重在馬鈴薯、甘蔗、菠蘿等遺傳背景非常復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)繁殖植物上，那時(shí)認(rèn)為無性系變異可能是供體植株中預(yù)先存在的變異或供體植株是細(xì)胞嵌合體造成的。以后在許多自交植物的體細(xì)胞再生植株和花粉植株上也觀察到高頻率的體細(xì)胞無性系變異。朱至清在評(píng)述性文章[55]中指出：體細(xì)胞無性系變異是長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)的普遍現(xiàn)象；變異頻率一般在百分之幾到百分之幾十之間，遠(yuǎn)高于自發(fā)突變頻率；變異頻率的高低與外植體來源及培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)；無性系變異是可以遺傳的。

關(guān)于體細(xì)胞無性系變異的可能機(jī)理[55][56]，有染色體數(shù)目變異、染色體結(jié)構(gòu)變異和基因突變?nèi)N解釋。在玉米無性系變異比較系統(tǒng)的研究中，發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常的頻率顯著超過染色體數(shù)目的異常。并發(fā)現(xiàn)斷裂頻率最高的第9染色體上具有一種能夠引起染色體斷裂的轉(zhuǎn)座子基因——Ds基因（dissociation基因），在另一種轉(zhuǎn)座子Ac（Activator激活子）的作用下，可以在其所在位點(diǎn)發(fā)生染色體斷裂；而Ds基因本身或者再帶著一些基因轉(zhuǎn)位到染色體的其他位點(diǎn)，同時(shí)染色體也發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變。20世紀(jì)80年代以來許多研究者試圖用這一轉(zhuǎn)座子學(xué)說來解釋無性系變異現(xiàn)象，主要論點(diǎn)如下：在組織培養(yǎng)過程中，細(xì)胞分裂速度很快，異染色質(zhì)復(fù)制落后，結(jié)果在細(xì)胞分裂后期形成染色體橋及斷裂；在斷裂部位（異染色質(zhì)區(qū)）DNA修復(fù)過程中，屬于異染色質(zhì)一部分的轉(zhuǎn)座基因發(fā)生去甲基化，因而被激活，發(fā)生轉(zhuǎn)座并引起一系列的結(jié)構(gòu)基因活化、失活和位置變化，造成無性系變異。也有研究者推測(cè)存在相反的可能性，即在組織培養(yǎng)中由于某些化學(xué)因素（如外源植物激素）或物理因素使轉(zhuǎn)座子（例如Ac轉(zhuǎn)座子）激活，然后通過Ds轉(zhuǎn)座子引起染色體斷裂和結(jié)構(gòu)變異。

體細(xì)胞無性系變異范圍較廣，單基因或少數(shù)基因變異的情況較多，這些變異可用來對(duì)現(xiàn)有品種進(jìn)行有限的修飾與改良，例如降低株高、提早成熟、增強(qiáng)抗性或改進(jìn)品質(zhì)等。這些品種改良技術(shù)在國(guó)內(nèi)外都有成功的范例。

1.3.6 組織培養(yǎng)與細(xì)胞編程死亡

細(xì)胞死亡可分為細(xì)胞壞死（necrosis）和細(xì)胞編程死亡（programmed cell death, PCD）兩類[57]。前者起因于外傷或環(huán)境劇變等偶然因素；后者屬生物體自身調(diào)控的生理性細(xì)胞死亡、細(xì)胞編程死亡或細(xì)胞凋亡（apoptosis）。多細(xì)胞生物體內(nèi)經(jīng)常不斷地發(fā)生細(xì)胞的新陳代謝，一方面不斷有新細(xì)胞產(chǎn)生和分化，另一方面老舊的、失去功能的、有害或多余的細(xì)胞不斷地被排除而死亡。可是植物學(xué)界對(duì)于細(xì)胞死亡研究甚少，直到20世紀(jì)受到動(dòng)物學(xué)和醫(yī)學(xué)上對(duì)這一問題深入研究的影響，80年代才引起重視。Gahan評(píng)述[58]了20世紀(jì)60～70年代以來各類植物細(xì)胞，如根冠、絨氈層、木質(zhì)部和韌皮部中管狀分子、貯藏組織、通氣道等形成過程中發(fā)生的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化以及細(xì)胞衰老和臨近死亡時(shí)呼吸作用的突然躍升和水解酶的擴(kuò)散等現(xiàn)象，明確地指出這種現(xiàn)象屬由遺傳控制的自殺性的PCD。

這種借PCD實(shí)現(xiàn)的新、老細(xì)胞新陳代謝對(duì)于維持多細(xì)胞生物正常的生長(zhǎng)發(fā)育（包括傳粉授精、胚胎發(fā)育）甚至離體形態(tài)發(fā)生都是必不可少的。例如在裸子植物歐洲云杉（Picea abies）體細(xì)胞胚離體形態(tài)發(fā)生過程中有兩次PCD發(fā)生高峰[59]：第一次高峰發(fā)生在增殖的前胚性細(xì)胞團(tuán)（pre-embryogenic masses）晚期，當(dāng)培養(yǎng)基中撤除生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素，激發(fā)前胚性細(xì)胞團(tuán)解體和體細(xì)胞胚開始形成時(shí)；第二次高峰發(fā)生在早期胚胎發(fā)生和胚柄消失時(shí)。在被子植物胚體發(fā)育到心形期，胚柄完成其功能后通過PCD而解體。

進(jìn)一步的研究揭示，PCD甚至在愈傷組織裂解和增殖過程中也起著重要作用。

胡蘿卜懸浮培養(yǎng)的愈傷組織團(tuán)塊由中央的分生組織細(xì)胞團(tuán)和周圍的高度液泡化的細(xì)胞組成。分生組織細(xì)胞的分裂使團(tuán)塊內(nèi)細(xì)胞數(shù)目增多，團(tuán)塊體積加大，其中又分化出許多液泡化的細(xì)胞使分生組織細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部分割成幾個(gè)亞單位；液泡化細(xì)胞的液泡化程度隨著愈傷組織團(tuán)塊增長(zhǎng)而增高。分生組織細(xì)胞團(tuán)的亞單位之間的高度液泡化的細(xì)胞死亡導(dǎo)致愈傷組織團(tuán)塊裂解。只要2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）存在，胡蘿卜懸浮培養(yǎng)的愈傷組織就在“生長(zhǎng)—裂解—再生長(zhǎng)—再裂解”的模式中循環(huán)往復(fù)[60]。PCD甚至影響由落葉松（Larix gmelini）未成熟胚衍生的不同類型的愈傷組織的外貌、質(zhì)地和裂解方式。它的愈傷組織團(tuán)塊也主要由上述兩類細(xì)胞組成，在活躍生長(zhǎng)的疏松型愈傷組織團(tuán)塊的亞單位之間存在著高度液泡化的、染色深的細(xì)胞。這些細(xì)胞解體之后，一個(gè)大的愈傷組織團(tuán)塊裂解成幾個(gè)小團(tuán)塊。這些高度液泡化的、染色深的細(xì)胞在原位末端標(biāo)記（TUNEL檢測(cè)）中呈陽性反應(yīng)，證明它們經(jīng)歷了PCD[61]。落葉松的致密型愈傷組織團(tuán)塊中，發(fā)生PCD的細(xì)胞數(shù)目比疏松型愈傷組織少得多，而且多不形成連續(xù)條帶，不易因其解體死亡而裂解，因此會(huì)長(zhǎng)成大的團(tuán)塊。

1.3.7 極性和相關(guān)現(xiàn)象

極性即細(xì)胞、器官區(qū)分為上、下端的現(xiàn)象，就像磁鐵一樣，不受外植體切割大小和長(zhǎng)短的影響，人為顛倒也不會(huì)改變它的極性，但可能影響胚胎或器官發(fā)生的速度和發(fā)育。在香雪蘭（Freesia refracta）花序離體胚胎發(fā)生的研究[62]中，王麗等觀察到體細(xì)胞胚總是發(fā)生在花序切段的形態(tài)學(xué)下端，而形態(tài)學(xué)上端無體細(xì)胞胚形成。他們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)初期內(nèi)源激素IAA在形態(tài)學(xué)下端的積累和特異性多肽的生物合成，導(dǎo)致體細(xì)胞胚形成最初的細(xì)胞分裂。

相關(guān)現(xiàn)象中最常見的是頂芽與腋芽的相關(guān)。頂芽維持頂端優(yōu)勢(shì)，抑制側(cè)芽伸展。欲通過組織培養(yǎng)加速繁殖可在采摘前事先摘除頂芽，促進(jìn)腋芽萌動(dòng)。但不同植物的頂端優(yōu)勢(shì)程度不同，易分蘗的禾本科植物頂端優(yōu)勢(shì)不明顯，喬木的頂端優(yōu)勢(shì)比灌木明顯。

1.3.8 植物的生理年齡

植物的生長(zhǎng)與動(dòng)物不同，為開放式頂端生長(zhǎng)，由頂端分生組織不斷產(chǎn)生新器官——幼葉和芽，芽伸展形成枝和葉。植物的幼年期和成年期常具有不同的特征，例如，二年生植物有以基生葉為特征的苗期（幼齡期）和以抽薹或抽穗為特征的成年期（成熟期）。這種情況在多年生木本植物，特別在喬木中表現(xiàn)得更為明顯，即在扦插、嫁接等園藝實(shí)踐中常常碰到的生理年齡問題。在木本植物中，生理年齡并不與器官形成的先后成正相關(guān)，喬木的樹冠部位的枝條為成熟期，下部的枝條屬幼齡期，樹干基部或根部長(zhǎng)出的萌蘗在生理上更年幼。與幼齡期枝條相比，成熟期枝條扦插或離體培養(yǎng)時(shí)不易生根，器官發(fā)生速度較慢。二者在激素含量上也有差異。組織培養(yǎng)實(shí)踐證明，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生能夠使已經(jīng)老化的培養(yǎng)物復(fù)壯，恢復(fù)到幼齡狀態(tài)。許多研究者認(rèn)為生物的老化是由于在發(fā)育過程中失活的基因越來越多。基因失活的原因之一是染色體DNA的甲基化[63]。胞質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的成熟水平起重要作用。如將一個(gè)成熟細(xì)胞的核移植到幼齡期細(xì)胞的胞質(zhì)中，細(xì)胞核往往可以向幼齡期逆轉(zhuǎn)，使整個(gè)細(xì)胞復(fù)壯[64]。但是對(duì)于形成生理年齡及復(fù)壯的機(jī)理迄今還不很清楚。在組織培養(yǎng)，特別是多年生木本植物組織培養(yǎng)中必須注意植物生理年齡問題，它影響到培養(yǎng)的效率和成敗。