2.4 免疫球蛋白的基因及其表達

根據克隆選擇學說，由于具有不同抗原特異性的淋巴細胞在引入抗原之前就已發育，而產生巨大抗體多樣庫所需的信息就表達在每一個體的DNA中。人類基因組中有效基因的總數約為3萬～5萬個，如果每一Ig的重鏈和輕鏈都是由單一的基因所編碼，人體內B細胞克隆的總數在1012以上，就需要一半以上能編碼功能性蛋白質的基因組來產生1012種特異性抗體，很顯然并非如此。每一Ig重鏈和輕鏈的多肽并非是由胚系基因組中連續的DNA序列所編碼的。相反，B細胞已具有特別有效的遺傳機制，能從有限數量的Ig基因中產生巨大的多樣庫。每一個體能產生抗體特異性的總和，稱為抗體庫（antibody repertoire），它反映了在抗原性刺激的應答中，所有B細胞克隆能夠合成和分泌Ig的能力。

免疫球蛋白的V區的氨基酸序列具有獨特性，不同的抗體之間彼此不同，C區的氨基酸序列在同一類免疫球蛋白的L鏈間或者H鏈間相對保守。這種既具有共享氨基酸序列，又具有獨特的氨基酸序列的多肽合成的遺傳機制是什么？加州理工學院的William Dreyer和阿拉巴馬大學的J.Claude Bennett于1965年提出假設，認為每一條抗體肽鏈實際上至少由兩個分隔存在的基因所編碼，一個是可變的，另一個是恒定的，在淋巴細胞發育過程中這兩個基因發生易位而重排在一起，并且這兩個基因在DNA或信使RNA（mRNA）水平上連接生成功能性免疫球蛋白。1976年，在瑞士巴塞爾研究所工作的美籍日本學者利根川進（Susumu Tonegawa）及其同事進行的一項具有里程碑意義的研究證實了該假說。他們在一種產生抗體的骨髓瘤或漿細胞瘤的研究中，發現其細胞的Ig基因結構與其他不承擔Ig合成的胚胎細胞的Ig基因不同。這一發現已由Southern點雜交技術所證明。該技術已被用于檢查經酶消化的DNA片段的大小。借助這種方法顯示出，在產生和不產生抗體的細胞中，Ig基因的DNA片段大小不同（圖2.17）。對這種DNA片段大小不同的解釋是，任何Ig輕鏈或重鏈的V區和C區均由不同的基因片段所編碼。這些基因片段在胚胎細胞中的定位相隔較遠，而在承擔抗體合成的細胞，如B細胞中卻連接在一起。這樣，Ig基因在B細胞的個體發育中經歷了DNA的重排或重組的過程。

Ig的分子由IGK, IGL和IGH基因編碼。人IGK, IGL和IGH基因分別定位于不同的2,22和14號染色體。小鼠IGK, IGL和IGH基因分別定位于不同的6,16和12號染色體（表2.4）。編碼一條Ig多肽鏈的基因是胚系中數個分隔開的DNA片段（基因片段）經重排而形成。1965年Dreyer和Bennett首先提出假說，認為Ig的V區和C區由分隔存在的基因所編碼，在淋巴細胞發育過程中這兩個基因發生易位而重排在一起。Tonegawa因在免疫球蛋白基因結構研究方面有重大突破而獲得1987年諾貝爾生理學與醫學獎。

2.4.1 免疫球蛋白基因的結構

Ig重鏈基因是由V, D, J和C四種不同基因片段所組成，Ig輕鏈基因是由V, J和C三種不同的基因片段所組成（圖2.18）。

1.Ig重鏈可變區（V區）基因

人重鏈基因座位于14號染色體。重鏈可變區基因是由V, D, J三種基因片32段經重排后所形成。編碼重鏈V區基因長約1000～2000 kb，包括V, D, J三組基因片段。每個V基因上游有L基因片段，編碼約20～30個疏水性氨基酸的先導序列（或稱信號肽）。

（1）重鏈V基因片段

根據小鼠VH基因片段核酸序列的相似性（＞80%同源性）可分為九個家族（family），每個家族含有2～60個成員不等，小鼠VH家族多為集群分布。人V基因片段65個，至少可分為VH1～VH7七個家族，同一個家族的片段并不在一起，多為與其他家族混雜分布。V基因片段編碼重鏈可變區約98個氨基酸殘基，包括互補決定區1和2（CDR1和CDR2）。

（2）重鏈D基因片段

D（diversity）是指多樣性。在Ig基因結構中，DH基因片段在VH基因的3′端，僅存在于重鏈基因中而不存在于輕鏈基因。D基因片段編碼重鏈V區大部分CDR3。人類DH片段有27個。

（3）重鏈J基因片段

J（Joining）指連接，是連接V和C基因的片段，位于DH基因的3′端。JH編碼約15～17個氨基酸殘基，包括重鏈V區CDR3中除DH編碼外的其余部分和第四骨架區。人有九個JH基因片段，其中六個是有功能的。CDR3對Ig特異性最為重要，可變程度相對也較大。

2.Ig重鏈恒定區（C區）基因

重鏈恒定區基因由多個外顯子組成，位于J基因片段的下游，至少相隔1.3kb。每個外顯子編碼一個結構域，鉸鏈區由單獨的外顯子所編碼，但α重鏈的鉸鏈區是由CH2外顯子的5′端所編碼。大多分泌的Ig重鏈C端片段或稱尾端（tail piece）是由最后一個CH外顯子的3′端所編碼，而δ鏈的尾端是由一個單獨的外顯子所編碼。小鼠CH基因約占2000 kb，其外顯子從5′端到3′端排列的順序是5′-Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cγ2b-Cγ2a-Cε-Cα-3′。人CH基因有功能的片段為九個，排列的順序是5′-Cμ-Cδ-Cγ3-Cγ1-Cα1-Cγ2-Cγ4-Cε-Cα2-3′。其中基因片段Cγ3-Cγ1-Cε2（ψCε，假基因）-Cα1和基因片段Cγ2-Cγ4-Cε-Cα2可能是一個片段經過復制而得，可為研究C區基因的起源和進化提供有用的依據。每個C基因包括幾個外顯子，編碼C區中相應的結構域。

3.Igκ鏈基因

人κ基因座位于2號染色體，Vκ基因片段有40個，編碼V區N端的1～95位氨基酸，包括CDR1, CDR2和部分CDR3。根據核苷酸序列同源性，Vκ可分VκⅠ～VκⅦ七個家族或亞群（subgroup）。Jκ基因位于Vκ基因的3′端，Jκ片段有五個，編碼V區靠近C端的第96～108氨基酸，Jκ與最后一個Vκ基因片段的3′端相距為23kb，但與Cκ外顯子靠近。Cκ只有一個，編碼C區（109～214氨基酸），所有κ輕鏈具有同一結構的C區。

4.Igλ鏈基因

人λ基因座位于22號染色體，Vλ有30個，可分為Vλ1～Vλ10十個家族，其中Vλ1～Vλ3是主要的家族，在進化上比較保守。Jλ基因片段和C基因片段的分布格局不同于H鏈和κ鏈基因，即Jλ與Cλ成對排列，四個Jλ和四個Cλ基因片段分別形成Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3和Jλ4-Cλ4的排列順序。

2.4.2 免疫球蛋白基因的重排

1．重組信號序列

Ig胚系基因中重鏈V, D和J基因片段，以及輕鏈V和J基因片段是通過基因片段的重排（rearrangement）而形成V基因的。重排過程主要由一組重組酶識別V,（D）, J基因片段兩側的重組信號序列，再通過切斷和修復DNA而實現的。

（1）重組信號序列

重組信號序列（recombination signal sequence, RSS）是由寡核苷酸組成的七聚體（heptamer）[5′CACAGTG3′]、九聚體（nonamer）[5′ACAAAAACC3′]，以兩者之間較少保守性的間隔序列（spacer）所組成。間隔序列的堿基數為12或23，此長度恰好允許DNA螺旋繞成一圈或兩圈，得以將七聚體和九聚體靠近在一起。在重組酶的識別和作用下，帶有12bp間隔序列的RSS基因片段只能和帶有23bp間隔序列的基因片段結合，保證了基因片段的正確連接，此現象稱為“12-23規則”（圖2.19和2.20）。

（2）重組信號序列與重鏈VDJ基因片段重排

重鏈VH基因片段3′端和JH基因片段的5′端都是帶有23bp間隔序列的RSS，而DH基因片段在5′和3′端都為帶12bp間隔序列的RSS，這種結構特點不允許重鏈V, J基因片段直接發生重排。現已知，重鏈V, D, J片段重排的順序是：先DH-JH重排，然后VH-DHJH重排（圖2.21）。

（3）重組信號序列與輕鏈VJ基因片段重排

以Vλ輕鏈為例，Vλ基因片段3′端的RSS帶有23bp間隔序列，Jλ基因片段5′端是含有12bp間隔序列的RSS。因此輕鏈基因的V, J片段可實現直接的連接（圖2.22）。

2.V（D）J重組酶

重組酶（recombinase）是一組參與V,（D）, J基因片段重組的酶，包括以下幾種。

（1）重組激活酶RAG-1和RAG-2

重組激活基因（recombination activating gene）編碼的重組激活酶RAG-1和RAG-2形成的復合物是一種內切酶，只表達在T和B細胞不成熟階段，在B細胞主要表達在B細胞前體至前B細胞。RAG-1/RAG-2以二聚體方式特異性識別36 RSS和切斷七聚體的一側。RAG-1/RAG-2基因敲除小鼠，由于淋巴細胞在發育過程中喪失BCR和TCR基因重排能力，因而不能發育成為成熟的B細胞和T細胞。

（2）末端脫氧核苷酸轉移酶

末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）表達于B細胞前體，此酶可將數個核苷酸通過不需要模板的方式加到DNA的斷端。

除RAG-1/RAG-2和TdT外，還有切開發夾結構的內切酶、參與修復DNA雙鏈斷端的DNA外切酶、DNA合成酶等，如DNA連接酶Ⅳ（DNA ligase Ⅳ）、DNA依賴的蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase, DNA-PK）、與DNA緊密相關的Ku70/Ku86二聚體。DNA-PK缺陷小鼠由于編碼V區基因片段之間的連接發生障礙而導致重癥聯合免疫缺陷（SCID）。

3.V（D）J重排

V（D）J重排的順序是在B細胞分化過程中，H基因先發生重排，重排成功就能單獨表達重鏈。重鏈基因重排后方開始輕鏈重排，一般κ鏈基因先重排，并表達κ輕鏈，與μ鏈組裝，在未成熟B細胞上最先出現mIgM；如果κ鏈重排失敗（nonproductive rearrangement），就轉為λ鏈基因的重排。在B細胞發育過程中，祖B細胞（pro-B cell）中就開始重鏈基因的重排，先D-J重排，后V-DJ重排。在重鏈基因重排開始時，兩條染色體上的D基因片段移位到J基因片段而發生D-J基因的連接。此后，只有一條染色體上的V基因片段與DJ基因片段發生重排。在一條染色體上重排成功后產生μ鏈，B細胞發育便進入前B細胞（pre-B cell）階段，此時輕鏈基因開始重排。只要有一條染色體重排成功表達κ輕鏈，B細胞膜上就出現單體膜型IgM（mIgM, μ2κ2），進入未成熟B細胞（immature B cell）階段。如果兩條染色體上的κ鏈基因都重排失敗，則啟動λ輕鏈基因的重排。

4.V（D）J與C基因片段的重排和免疫球蛋白類別轉換

1964年Nossal等發現B細胞存在著類別的轉換。Ig類別轉換（class switch）或稱同種型轉換（isotype switch）是指一個B細胞克隆在分化過程中VH基因（VDJ）保持不變，而按一定順序與不同的CH基因片段分別發生重排。比較與不同CH基因片段重排后基因編碼的重鏈，它們的V區相同，而C區不同，即識別抗原特異性不變，而Ig類或亞類發生改變。這種類別轉換在無明顯誘因下可自發產生，當抗原激活B細胞，無論是mIg，或是所分泌的Ig，可從IgM轉換成IgG, IgA或IgE等類別或亞類。Ig類別轉換可能通過以下兩種方式實現。

（1）缺失模型（deletion model）

以小鼠CH基因為例，如Cμ和Cδ基因片段被缺失，那么先前重排的VDJ就會按照順序與下一個CH基因即Cγ3發生重排，經轉錄和翻譯后，編碼γ3重鏈；如缺失所有的γ鏈亞類基因片段，依次會產生ε重鏈。上述模型在被刺激后小鼠B細胞在體外培養中產生Ig類別的順序得到證實，即先產生IgM，然后依次產生IgG3和IgG1等。轉換區（switch region）即S區是重鏈基因組內含子中的一段重復性DNA序列，與Ig類和亞類的轉換有密切的關系。除Cδ外，各個恒定區基因片段上游都有S區，分別命名為Sμ, Sγ1, Sα和Sε等。S區內含有眾多串聯的高度保守的DNA重復序列，如Sμ的結構為[（GAGCT）nGGGGT]m，其中n一般為2～5，通常為3，有時多達7, m可達150。當B細胞合成IgG1時，Sμ與Sγ1首先發生結合，在兩者之間的Cμ, Cδ和Cγ3基因片段被環出（looping out），由先前重排好的V區基因（VDJ）與Cγ1基因片段重排，轉錄成初級RNA轉錄本，剪切成mRNA，翻譯為γ1重鏈。在小鼠，B細胞經T細胞非依賴性活化常發生Sμ/Sγ或Sμ/Sγ2b的重組，因而LPS活化小鼠B母細胞，分泌Ig從IgM轉換為IgG3和IgG2b。而且在B細胞類別轉換時可以不止一次，通過分別轉換到不同的C基因，從而表達相應不同的Ig類或亞類（圖2.23）。

（2）RNA的可變剪切

除DNA水平缺失模型使Ig類別發生轉換外，RNA水平的替代剪切（alternative splicing）也可產生不同的Ig類型。Cμ和Cδ基因片段之間無S區，IgM和IgD共表達的B細胞系DNA分析表明，Cμ和Cδ基因片段沒有發生重排，相同的VH出現在編碼μ或δ鏈的mRNA上，表明它們可能有一個共同的mRNA前體，通過差異剪切（differential splicing）分別形成μ鏈mRNA和δ鏈mRNA（圖2.22）。初級RNA轉錄本（primary RNA transcript）是由V區（VDJ）基因連接Cμ和Cδ基因片段經轉錄后形成。如果在剪切過程中切除初級RNA轉錄本中的Cδ部分，則經加工后形成μmRNA；如初級RNA轉錄本中將Cμ部分切除，則加工后形成δmRNA。這兩種mRNA分別被翻譯，使單個B細胞同時產生μ鏈和δ鏈，同時表達IgM和IgD。

5.Ig基因的轉錄和輕鏈、重鏈合成以及裝配

在V區基因片段重排連接成完整的V基因后，它和C基因之間還間隔有一段非編碼的DNA序列，這段序列仍存在于初級RNA的轉錄本中，需通過轉錄后加工去除。首先由位于每個V基因片段上游的啟動子啟動轉錄，形成RNA前體或稱初級RNA轉錄物，然后再經過剪切加工成mRNA，即將先導序列、V基因和C基因連接在一起，其中C基因數個外顯子間的內含子也被剪切掉。mRNA離開細胞核進入胞質與核糖體結合，翻譯成輕鏈或重鏈。Ig多肽鏈的前導序列與信號識別蛋白形成復合物結合在內質網上，前導肽被切除，合成肽鏈進入內質網。在內質網上輕鏈和重鏈配對結合，組裝好Ig從內質網移行到高爾基體，進行糖基化，并繼續運送到細胞表面，如重鏈C端側帶有疏水性氨基酸便錨著在膜上成為mIg，如C端無疏水性氨基酸則分泌到細胞外成為分泌型的Ig。

Ig重鏈重排后，其第一個骨架區（FR1）到FR3都是由VH基因片段所編碼，其中包括CDR1和CDR2，而重鏈可變區中的CDR3則是由VH-DH-JH三種基因片段組合的產物。輕鏈CDR1和CDR2也由相應的Vκ或Vλ基因片段編碼，輕鏈V區中CDR3是由Vκ-Jκ或Vλ-Jλ兩種基因片段組合的產物。CDR3尤其是重鏈V區的CDR3，由于在VH-DH-JH組合時D-J或V-DJ之間還可能有N區的插入，其變化明顯要多于CDR1和CDR2，加之CDR3編碼區域體細胞高突變頻率也明顯高于CDR1和CDR2，因此，在大多數情況下，重鏈和輕鏈CDR3在Ig結合抗原的特異性中起著主要的作用。在基因工程抗體的設計時，有重要意義。

6．膜型Ig重鏈基因

膜表面Ig（mIg）重鏈基因的外顯子結構與分泌型Ig重鏈的基因外顯子結構基本相同，但在基因組的3′端有所差別。作為識別抗原受體的mIg，其重鏈C端有一段疏水性氨基酸插入到胞膜的脂質雙層中，mIg重鏈的轉錄本要比分泌型重鏈轉錄本多兩個外顯子，與分泌型Ig重鏈基因最下游一個外顯子至少相隔1.4 kb，這兩個外顯子編碼重鏈的C端部分，這部分氨基酸殘基的數目視重鏈不同而有所差異。如鼠或人mIgμ鏈的這一部分約為41個氨基酸殘基，而鼠mIgε鏈這部分卻有72個氨基酸殘基。這個區域可分為三個部分：①一個酸性間隔子，靠N端側，與最后一個CH結構域相連，位于細胞膜外側；②跨膜部分，由26個疏水氨基酸穿過胞膜的脂質雙層；③胞漿區C端部分，3～28個氨基酸殘基不等。

分泌形式的μ, α和δ重鏈最后一個結構域后有一段額外延長的、由帶電荷氨基酸組成的序列，稱為尾片，約含20個氨基酸。在IgM和IgA分子中，單體Ig尾片中半胱氨酸通過二硫鍵相互連接或與J鏈連接形成二聚體或多聚體。分泌型μ鏈的mRNA含有V, D, J, Cμ1, Cμ2, Cμ3和Cμ4的3′端一個小的外顯子轉錄區。

2.4.3 免疫球蛋白基因表達的調節

免疫球蛋白基因的表達受到多方面因素的調節，主要有轉錄因子和細胞因子40的調節，前者主要調節Ig基因表達的水平，后者主要與Ig類和亞類的轉換有關。此外，Ig基因表達過程中存在著等位排斥和同型排斥的規律。

1．核因子對Ig基因轉錄的調節作用

Ig基因轉錄活性是由兩個順式作用元件（cis-acting element）即啟動子（promoter, P）和增強子（enhancer, E）來調節。而啟動子和增強子的功能又由反式作用的核因子（trans-acting nuclear factor）所控制。這些核因子也稱為DNA結合蛋白（DNA-binding protein, DBP），結合到啟動子或增強子內特異的核苷酸序列，從而抑制或刺激啟動子和增強子的活性。DBP又稱轉錄因子（transcription factor）。轉錄因子通常是細胞受到某些刺激后所誘導表達的，起到連接細胞外刺激和基因表達調控的作用。

2．細胞因子對Ig類別轉換的調節

局部微環境和細胞因子可影響和調節免疫球蛋白類型的轉換，如在腸道派爾集合淋巴結的B細胞V基因優先轉換到Cα1基因片段進行重排，因此主要合成和分泌IgA；在體外向經LPS刺激的小鼠B細胞中加入IL-4，可促進B細胞產生IgG1和IgE，抑制IgM, IgG3和IgG2 a產生；而IFN-γ，則誘導小鼠B細胞合成IgG2 a和IgG3，抑制IgE, IgM和IgG1的產生；TGF-β和IL-5對IgA產生具有促進作用。細胞因子調節B細胞Ig類別轉換的機制可能是：①刺激某些細胞的克隆選擇性的增殖，使分泌某特定類、亞類抗體的克隆細胞增加，如IL-5促進IgA產生的機制，除通過同種型轉換進行調節外，還可選擇性促進B細胞定向細胞分化增殖為IgA分泌細胞；②通過誘導特定的兩個轉換區的重組，誘導B細胞由分泌IgM向某一同種型Ig轉換，如高濃度IL-4促進LPS誘導小鼠B細胞產生IgE，主要是使Cε轉換區（Sε）與小鼠B細胞Sμ結合，通過同種型轉換促進IgE的產生。

3．等位排斥和同型排斥

1）等位排斥（allelic exclusion）是指B細胞中一對同源染色體上的輕鏈或重鏈基因，其中只有一條染色體上的基因得到表達。如一條14號染色體上的重鏈基因發生有效重排后，通過產生反饋控制信號抑制了另一條同源染色體上Ig重鏈基因的重排，并可能發出信號，使2號染色體上Igκ輕鏈基因開始發生重排。一個B細胞只能表達一種輕鏈和一種重鏈，配對后產生一種特異性Ig。一般來說，兩個等位基因表達的概率是相同的，其先后取決于哪個等位基因先重排成功。

2）同型排斥（isotype exclusion）或稱輕鏈同型排斥，是指Igκ和λ輕鏈中兩種型中擇一表達。在不同物種中表達κ或λ輕鏈的概率并不相同，如在小鼠κ∶λ的比值約為95∶5，在人是65∶35。

2.4.4 免疫球蛋白的多樣性

一個動物能對大量不同的和以前從未接觸過的抗原發生反應，就必須存在著極大量的能與不同抗原結合部位結合的抗體庫。每一種抗體由單一克隆B細胞或其后代漿細胞所分泌。因此，抗原結合部位的多樣性就意味著要產生大量不同的B細胞克隆，每個B細胞克隆分泌一種與特定抗原結合的抗體。隨著機體進化，已能產生大量B細胞克隆，合成含不同抗原結合區的抗體。了解抗體多樣性（antibody diversity）或抗體的譜（antibody repertoire）形成的機制具有重要的意義。

機體對外界環境中眾多抗原刺激可產生相應的特異性抗體，人體內B細胞克隆的總數在1012以上，估計機體可產生1012不同類型的抗原結合區，即產生1012種特異性抗體。抗體多樣性主要由遺傳控制，其機制包括：①存在眾多基因編碼片段，每個基因片段特異性編碼不同的抗原結合部位；②不同重鏈和輕鏈的隨機取用和組合；③VDJ基因片段重組時連接的多樣性，促進了產生抗體可變區序列的多樣性，連接區核苷酸的隨機插入更增加了新的多樣性；④體細胞的高突變。其中前三種機制是發生于骨髓B細胞發育早期，而體細胞高突變發生在二級淋巴器官B細胞功能性Ig基因形成之后。輕鏈和重鏈可變區形成抗原結合部位。