第一章　緒論

第一節　常用儀器設備的使用

生物技術是涉及基因工程、分子生物學、生物化學、遺傳學、細胞生物學、胚胎學、免疫學、有機化學、無機化學、物理化學、物理學、信息學及計算機科學等的多學科技術，其中不乏使用有毒化學藥品及微生物，因此，在實驗操作過程中要嚴格遵守實驗室操作規范。

一、離心機

離心機是生物實驗室常用的儀器設備，可以利用離心力將懸浮的固體顆粒與液體分開；或將乳濁液中兩種密度不同又互不相溶的液體分開；也可用于排除濕固體中的液體。離心機如圖1-1所示。

1.工作原理

離心機的作用原理有離心過濾和離心沉降兩種。離心過濾是使懸浮液在離心力場下產生的離心壓力作用在過濾介質上，使液體通過過濾介質成為濾液，而固體顆粒被截留在過濾介質表面，從而實現液-固分離；離心沉降是利用懸浮液（或乳濁液）密度不同的各組分在離心力場中迅速沉降分層的原理，實現液-固（或液-液）分離。衡量離心機分離性能的重要指標是分離因數。它表示被分離物料在轉鼓內所受的離心力與其重力的比值，分離因數越大，通常分離也越迅速，分離效果越好。

2.使用守則

①離心機在預冷狀態時，離心機蓋必須關閉，離心結束后取出轉頭要倒置于實驗臺上，擦干腔內余水，離心機蓋處于打開狀態。

②轉頭在預冷時轉頭蓋可擺放在離心機的平臺上，或擺放在實驗臺上，千萬不可不擰緊浮放在轉頭上，因為一旦誤啟動，轉頭蓋就會飛出，造成事故！

③轉頭蓋在擰緊后一定要用手指觸摸轉頭與轉蓋之間有無縫隙，如有縫隙要擰開重新擰緊，直至確認無縫隙方可啟動離心機。

④在離心過程中，操作人員不得離開離心機室，一旦發生異常情況，操作人員不能關電源（POWER），要按STOP。在預冷前要填寫好離心機使用記錄。

⑤不得使用偽劣的離心管，不得用老化、變形、有裂紋的離心管。

⑥在節假日和晚間最后一個使用離心機的人例行安全檢查后方能離去。

3.使用注意事項

目前，實驗室常用的是電動離心機，電動離心機轉動速度快，要注意安全，特別要防止在離心機運轉期間，因不平衡或試管墊老化而使離心機邊工作邊移動，以致從實驗臺上掉下來，或因蓋子未蓋，離心管因振動而破裂后，玻璃碎片旋轉飛出，造成事故。因此，使用離心機時，必須注意以下操作。

①離心機套管底部要墊棉花或試管墊。

②電動離心機如有噪聲或機身振動時，應立即切斷電源，即時排除故障。

③離心管必須對稱放入套管中，防止機身振動，若只有一支樣品管，另外一支要用等質量的水代替。

④啟動離心機時，應蓋上離心機頂蓋后，方可慢慢啟動。

⑤分離結束后，先關閉離心機，在離心機停止轉動后，方可打開離心機蓋，取出樣品，不可用外力強制其停止運動。

⑥離心時間一般為1～2min，在此期間，實驗者不得離開去做別的事。

二、移液管

移液管是一種量出式儀器，如圖1-2所示，只用來測量它所放出溶液的體積。它是一根中間有一膨大部分的細長玻璃管，其下端為尖嘴狀，上端管頸處刻有一條標線，是所移取的準確體積的標志。常用的移液管有5mL、10mL、25mL和50mL等規格。通常又把具有刻度的直形玻璃管稱為吸量管。常用的吸量管有1mL、2mL、5mL和10mL等規格。移液管和吸量管所移取的體積通常可準確到0.01mL。

移液管的使用步驟如下。

（1）使用前　使用移液管，首先要看一下移液管標記、準確度等級、刻度標線位置等。使用移液管前，應先用鉻酸洗液潤洗，以除去管內壁的油污。然后用自來水沖洗殘留的洗液，再用蒸餾水洗凈。洗凈后的移液管內壁應不掛水珠。移取溶液前，應先用濾紙將移液管末端內外的水吸干，然后用欲移取的溶液涮洗管壁2～3次，以確保所移取溶液的濃度不變。

（2）吸液　用右手的拇指和中指捏住移液管的上端，將管的下口插入欲吸取的溶液中，插入不要太淺或太深，一般為10～20mm處，太淺會產生吸空，把溶液吸到洗耳球內弄臟溶液，太深又會在管外沾附溶液過多。左手拿洗耳球，先把球中空氣壓出，再將球的尖嘴接在移液管上口，慢慢松開壓扁的洗耳球使溶液吸入管內，先吸入該管容量的1/3左右，用右手的食指按住管口，取出，橫持，并轉動管子使溶液接觸到刻度以上部位，以置換內壁的水分，然后將溶液從管的下口放出并棄去，如此用溶液反復洗3次后，即可吸取溶液至刻度以上，立即用右手的食指按住管口。

（3）調節液面　將移液管向上提升離開液面，管的末端仍靠在盛溶液器皿的內壁上，管身保持直立，略微放松食指（有時可微微轉動吸管）使管內溶液慢慢從下口流出，直至溶液的彎月面底部與標線相切為止，立即用食指壓緊管口。將尖端的液滴靠壁去掉，移出移液管，插入承接溶液的器皿中。

（4）放出溶液　承接溶液的器皿如是錐形瓶，應使錐形瓶傾斜30°，移液管直立，管下端緊靠錐形瓶內壁，稍松開食指，讓溶液沿瓶壁慢慢流下，全部溶液流完后需等15s后再拿出移液管，以便使附著在管壁的部分溶液得以流出。如果移液管未標明“吹”字，則殘留在管尖末端內的溶液不可吹出，因為移液管所標定的量出容積中并未包括這部分殘留溶液。

三、移液器

移液器又稱移液槍（pipettes或transferpette），是一種用于定量轉移液體的儀器，被廣泛用于生物、化學等領域，如圖1-3所示。

1.工作原理

移液器的工作原理是活塞通過彈簧的伸縮運動來實現吸液和放液。在活塞推動下，排出部分空氣，利用大氣壓吸入液體，再由活塞推動空氣排出液體。使用移液器時，配合彈簧的伸縮性特點來操作，可以很好地控制移液的速度和力度。

2.使用步驟

一個完整的移液循環，包括吸頭安裝—容量設定—預洗吸頭—吸液—放液—卸掉吸頭等六個步驟。每一個步驟都有需要遵循的操作規范。

（1）吸頭安裝　采用旋轉安裝法安裝吸頭，具體的做法為，把移液器白套筒頂端插入吸頭（無論是散裝吸頭還是盒裝吸頭都一樣），在輕輕用力下壓的同時，把手中的移液器按逆時針方向旋轉180°。

（2）容量設定　采用兩步法設定移液器容量，一是粗調，即通過排放按鈕將容量值迅速調整至接近自己的預想值；二是細調，當容量值接近自己的預想值以后，應將移液器橫置，水平放至自己的眼前，通過調節輪慢慢地將容量值調至預想值，從而避免視覺誤差所造成的影響。

（3）預洗吸頭　在我們安裝了新的吸頭或增大了容量值以后，應該把需要轉移的液體吸取、排放2～3次，使吸頭內壁形成一道同質液膜，確保移液工作的精度和準度，使整個移液過程具有極高的重現性。其次，在吸取有機溶劑或高揮發液體時，揮發性氣體會在白套筒室內形成負壓，從而產生漏液的情況，這時就需要我們預洗4～6次，讓白套筒室內的氣體達到飽和，負壓就會自動消失。

（4）吸液　先將移液器排放按鈕按至第一停點，再將吸頭垂直浸入液面，浸入的深度為：P2、P10小于或等于1mm，P20、P100、P200小于或等于2mm，P1000小于或等于3mm，P5mL、P10mL小于或等于4mm，平穩松開按鈕，切記不能過快。

（5）放液　放液時，吸頭緊貼容器壁，先將排放按鈕按至第一停點，略做停頓以后，再按至第二停點，這樣做可以確保吸頭內無殘留液體。

（6）卸掉吸頭　卸掉的吸頭一定不能和新吸頭混放，以免產生交叉污染。

3.使用注意事項

①設定移液體積：從大量程調節至小量程為正常調節方法，逆時針旋轉刻度即可從小量程調節至大量程時，應先調至超過設定體積刻度，再回調至設定體積（這是因為計數器里面有一定的空隙，需要彌補），這樣可以保證移液器的精確度。

②裝配移液槍頭：將移液槍垂直插入吸頭，左右旋轉半圈，上緊即可。切記用力不能過猛，用移液器撞擊吸頭，長期這樣操作會導致移液器的零件因撞擊而松散，嚴重時會導致調節刻度的旋鈕卡住。

③吸液及放液：吸液時，浸入過深的話，液壓會對吸液的精確度產生一定的影響。吸液前槍頭先在液體中預潤洗，慢吸慢放，放液時如果量很小則應使吸頭尖端靠容器內壁。

④吸有液體的移液槍不應平放，槍頭內的液體很容易污染槍內部而導致槍的彈簧生銹。

⑤移液槍在每次實驗后應將刻度調至最大，讓彈簧回復原型以延長移液槍的使用壽命。

⑥吸取液體時一定要緩慢平穩地松開拇指，絕不允許突然松開，以防將溶液吸入過快而沖入取液器內腐蝕柱塞而造成漏氣。

⑦為獲得較高的精度，吸頭需預先吸取一次樣品溶液，然后再正式移液，因為吸取血清蛋白質溶液或有機溶劑時，吸頭內壁會殘留一層“液膜”，造成排液量偏小而產生誤差。

⑧濃度和黏度大的液體，會產生誤差，為消除其誤差的補償量，可由試驗確定，補償量可用調節旋鈕改變讀數窗的讀數來進行設定。

⑨在設置量程時，請注意旋轉到所需量程數字清清楚楚地顯示在顯示窗中，所設量程在移液器量程范圍內不要將按鈕旋出量程，否則會卡住機械裝置，損壞移液器。

⑩移液器嚴禁吸取有強揮發性、強腐蝕性的液體（如濃酸、濃堿、有機物等）。

嚴禁使用移液器吹打混勻液體。

不要用大量程的移液器移取小體積的液體，以免影響準確度。同時，如果需要移取量程范圍以外較大量的液體，請使用移液管進行操作。

四、高壓滅菌鍋

高壓滅菌鍋（全自動高壓蒸汽滅菌鍋見圖1-4）適用于醫療衛生事業、科研、農業等單位，可用于醫療器械、敷料、玻璃器皿、溶液培養基等的消毒滅菌。

1.使用步驟

（1）開蓋　向左轉動手輪數圈，直至轉動到頂，使鍋蓋充分提起，拉起左立柱上的保險銷，向右推開橫梁，移開鍋蓋。

（2）通電　接通電源，此時欠壓蜂鳴器響，顯示本機鍋內無壓力（當鍋內壓力升至約0.03MPa時蜂鳴器自動關閉），控制面板上的低水位燈亮，鍋內屬斷水狀態。

（3）加水　將純水或生活用水直接注入蒸發鍋內約8L，同時觀察控制面板上的水位燈，當加水至低水位燈滅、高水位燈亮時停止加水。當加水過多發現內膽有存水，開啟下排汽閥放去內膽中的多余水量。

（4）放樣　將滅菌物品儀器堆放在滅菌筐內，各包之間留有間隙，有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。密封：把橫梁推向左立柱內，橫梁必須全部推入立柱槽內，手動保險銷自動下落鎖住橫梁，旋緊鍋蓋。

（5）設定溫度和時間　按一下確認鍵，進入溫度設定狀態，按上下鍵可以調節溫度值，再次按下確認鍵，進入時間設定狀態，按左鍵或上下鍵設置需要的時間，再次按動確認鍵，設定完成，儀器進入工作狀態，開始加熱升溫。

（6）滅菌結束后，關閉電源，待壓力表指針回落零位后，開啟安全閥或排汽排水總閥，放凈滅菌室內的余氣。若滅菌后需迅速干燥，需打開安全閥或排汽排水總閥，讓滅菌器內的蒸汽迅速排出，使物品上殘留的水蒸氣快速揮發。滅菌液體時嚴禁使用干燥方法。

（7）啟蓋　同步驟（1）。

2.使用注意事項

①堆放滅菌包時應注意安全閥放汽孔位置必須留出空隙，保障其暢通，否則易造成鍋體爆裂事故。

②滅菌液體時，應將液體灌裝在耐熱玻璃瓶中，以不超過3/4體積為好，瓶口選用棉花紗塞。

③對高壓滅菌鍋進行補水時盡量使用純水，以防產生水垢。

五、PCR儀的使用

PCR（polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應），是在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，只需在試管中建立反應，經數小時后，就能將極其微量的目的基因或某一特定DNA片段擴增數十倍到千百萬倍。PCR技術可用于分離和擴增目的基因、基因突變檢測、疾病診斷等領域。

1.PCR技術原理

在微量離心管中，加入適量的緩沖液，微量的模板DNA、四種脫氧單核苷酸、耐熱性多聚酶和引物，通過高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個階段為一個循環的反應過程，每一次循環使特異區段的基因拷貝數放大一倍，一般樣品經過30次循環，最終使基因放大了數百萬倍（圖1-5）。

2.PCR儀的使用

本書僅以BioRad T100 PCR儀為例（圖1-6），簡單介紹PCR儀的使用，不同廠家生產的PCR儀的使用參考廠家所提供的說明書進行。

（1）創建新程序

①主菜單上點擊New Protocol。

②NewProtocol界面顯示圖形視圖模式的程序。點擊相應的按鍵設定對應的參數：溫度、時間、循環數、GOTO循環開始步驟、樣品體積、熱蓋溫度。

③如果想選擇一個步驟，點擊溫度鍵以外的空白區域，該步驟會高亮顯示。此時可在該步驟后增加新步驟、刪除所選步驟或重新輸入該步驟的參數。

④點擊Insert按鍵增加實驗步驟。菜單會顯示所需增加的步驟類型。溫度固定的步驟選擇Temperature，溫度梯度步驟選擇Gradient，典型循環步驟（變性、退火和延伸）選擇GOTO。

⑤點擊Delete，刪除實驗步驟。

⑥如果實驗步驟需要設置高級參數，如溫度、增減溫度、時間、延伸時間、梯度和升降溫速率，請點擊Options。

⑦點擊Save保存程序。

⑧點擊Run運行程序。如果無需保存，可在設置Run過程中隨時點擊開始運行。

（2）運行和保存已有程序

①在主界面選擇Saved Protocols。T100 PCR儀支持程序文件夾管理系統，Main文件夾內預裝20個標準程序。

②在文件夾列表內選擇文件夾，在所選文件夾內選擇需要的程序。

③在右側預覽欄可以預覽所選程序。

④點擊Run開始運行程序，或選擇Edit編輯所選程序。

3.PCR儀使用注意事項

①PCR儀使用的環境要恒定，工作環境的溫度不能過高或過低，最好在有空調的房間使用，有些PCR儀有溫度保護程序，在過低的溫度下機器不能啟動。

②PCR儀使用的電源要穩定，工作的電壓不能波動過大，波動過大會造成電子器件損壞，一般建議將PCR儀電源接于穩壓電源上。

③PCR儀在使用前要詳細閱讀使用說明書，遇到不能解決的問題不要隨意拆卸機器，應該讓生產廠商負責售后服務的專業工程師進行處理。

六、超凈工作臺

超凈工作臺（圖1-7）是一種局部凈化設備，即利用空氣潔凈技術使一定操作區內的空間達到相對的無塵、無菌狀態，主要由空氣過濾裝置、紫外殺菌裝置、操作臺三部分構成。

1.工作原理

通過風機將空氣吸入預過濾器，經由靜壓箱進入高效過濾器過濾，將過濾后的空氣以垂直或水平氣流的狀態送出，使操作區域達到百級潔凈度，保證生產對環境潔凈度的要求。超凈工作臺根據氣流的方向分為垂直流超凈工作臺和水平流超凈工作臺，根據操作結構分為單邊操作及雙邊操作兩種形式，按其用途又可分為普通超凈工作臺和生物（醫藥）超凈工作臺。

2.使用步驟

①檢查超凈工作臺的操作環境，如環境溫度、空氣質量、電源等，登記使用信息。

②將實驗需要的器材擺放到超凈工作臺臺面上，滅過菌的材料如培養基等放左側，工具放右側。

③拉下玻璃擋板，開啟紫外線燈照射30min進行表面滅菌。

④30min后關閉紫外線燈，打開風機調節至適當的風量，打開照明燈。

⑤打開玻璃擋板至約20cm高，兩只手在操作臺內可以順利操作，用75％酒精擦拭雙手和臺面。

⑥點燃酒精燈，操作過程嚴格遵循無菌操作規范。

⑦操作完成后將實驗器材清理出無菌操作臺，75％酒精擦拭臺面，關閉照明、風機和擋板。

⑧開啟紫外線燈照射15min后關閉紫外線燈。

3.使用注意事項

①超凈工作臺內嚴禁長時間存放物品。

②紫外線對皮膚和視網膜有很強的刺激性，避免紫外線直射，單層玻璃即可有效阻擋紫外線。

③操作過程應嚴格遵守無菌操作規范。

④避免頻繁開關紫外線燈管和照明燈管，延長燈管的使用壽命。

⑤定期檢查空氣濾網等濾材，老化嚴重應更換。

七、紫外-可見分光光度計

紫外-可見分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry）通常是指利用物質對200～800nm光譜區域內的光具有選擇性吸收的現象，對物質進行定性和定量分析的方法。按測量光的單色程度（即含波長范圍的寬窄程度）分為分光光度法（spectrophotometry）和比色法（colorimetry）。利用比較溶液顏色深淺的方法來確定溶液中有色物質的含量的方法稱比色法。應用分光光度計，根據物質對不同波長的單色光的吸收程度不同而對物質進行定性和定量分析的方法稱分光光度法（又稱吸光光度法）。分光光度法中，按所用光的波譜區域不同，又可分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。在紫外及可見光區用于測定溶液吸光度的分析儀器稱為紫外-可見分光光度計（簡稱分光光度計，見圖1-8）。

1.工作原理

物質的紫外-可見光譜直接地反映了物質分子的電子躍遷，與物質的結構直接相關，不同的物質其紫外-可見吸收光譜不同，而吸收強弱又與吸光物質的量有關。因此，可以由物質光譜的特異性對物質進行定性分析，并根據吸收強度對物質做定量測試。

在一定的條件下，吸光物質對單色光的吸收符合朗伯-比爾定律，即A=εbc［A為吸光度；b為光程長度（即吸收池厚度），cm；c為吸光物質的物質的量濃度，mol/L；ε為摩爾吸光系數，L/（mol·cm）］；當b、ε一定時，吸光物質的吸光度為其濃度c的單值（線性）函數。因此，對吸光物質的濃度的測試可直接歸結為對吸光度A的測試。

2.使用步驟

①取下防塵罩，將靈敏度調節鈕置于“1”擋（信號放大倍率最小），將選擇開關置于“τ”擋。

②打開試樣室蓋，檢查樣品室內是否放有遮光物，若有則取出。插上電源插頭，按下電源開關，指示燈亮，儀器預熱20min。

③調節波長旋鈕，使測試所需波長值對準標線。

④在試樣室蓋打開的情況下，調節“0％τ”旋鈕，使顯示器顯示為“000.0”。

⑤用所要裝盛的溶液潤洗潔凈的吸收池后，倒入相應的溶液（注意！溶液不可裝太滿，以免逸出腐蝕儀器，一般裝至池高的2/3～4/5即可），用濾紙吸干吸收池外壁水珠；用擦鏡紙擦亮透光面。將盛參比溶液的吸收池置于試樣架的第一格內（靠操作者身邊），盛試樣的吸收池按試樣編號依次置于第二、三、四格內，用彈簧夾固定好，蓋上試樣室蓋。

⑥將參比溶液推入光路，調節“100％τ”旋鈕，使之顯示為“100.0”，如果顯示不到“100.0”則要增大靈敏度擋，然后再調節“100％τ”旋鈕，直到顯示為“100.0”。

⑦重復操作④和⑤，直到顯示穩定。

⑧穩定地顯示“100.0”透射比后，將選擇開關置于“A”擋，此時吸光度顯示應為“.000”；若不是，則調節吸光度調零鈕，使顯示為“.000”。將試樣推入光路，這時的顯示值即試樣的吸光度。

⑨若測量濃度c，先將選擇開關旋至“C”擋，將已知濃度的溶液推入光路，調節濃度旋鈕，使數字顯示器顯示為標定值，再將被測溶液推入光路，則顯示值即為被測溶液相應的濃度值。

⑩儀器使用完畢，關閉電源（短時間不用，不必關閉電源，只需打開試樣室蓋，即停止照射光電管），洗凈吸收池并放回原處，儀器冷卻10min后蓋上防塵罩。

3.操作注意事項

①實驗過程中，參比溶液不要拿出試樣室，可隨時將其置入光路以檢查吸光度零點是否有變化。如不為“.000”，則不要先調節吸光度調零鈕，而應將選擇開關置于“τ”擋，用“100％τ”旋鈕調至“100.0”，再將選擇開關置于“A”，這時如不為“.000”方可調節吸光度調零鈕（一般情況下不需要經常調節吸光度調零鈕和“0％τ”旋鈕）。

②實驗過程中，若大幅度改變測試波長，需等數分鐘才能正常工作（因波長大幅度改變，光能量變化急劇，光電管響應遲緩，需一段光響應平衡時間）。