實驗三　動物組織總RNA的提取

實驗目的

（1）掌握動物組織RNA提取的一般原理。

（2）通過提取動物組織RNA，掌握TRIzol法提取RNA的方法和步驟。

實驗原理

TRIzol試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性，裂解細胞并釋放出RNA，酸性條件使RNA與DNA分離，加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白（圖2-1）。

RNA的完整性對于后續(xù)實驗至關(guān)重要。而導致RNA降解最主要的物質(zhì)為空氣中的RNase。RNase非常穩(wěn)定，在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后又迅速復性。用常規(guī)的高溫高壓蒸汽滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學實驗中，應注意以下幾個方面。

①經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細菌、霉菌可能成為RNase的來源。

②使用滅過菌的RNA專用塑料制品，避免交叉污染。

③RNA提取過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

試劑與儀器

1.試劑和溶液

（1）TRIzol試劑。

（2）無RNase水　將水加入處理過的不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.05％（體積分數(shù)），充分混勻后37℃放置過夜，高壓滅菌。

（3）75％乙醇、氯仿、異丙醇、去離子水、高鹽溶液（0.8mol/L檸檬酸鈉和1.2mol/L NaCl）、DEPC。

2.儀器設備

離心機、制冰機、勻漿器、1.5mL離心管（RNase-free）、槍頭（RNase-free）、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、移液器、烘箱、冰箱。

實驗步驟

（1）實驗準備

①采用DEPC配制的75％乙醇擦洗臺面及相關(guān)儀器設備表面。

②在玻璃和塑料制品中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1％，室溫處理過夜，將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住用含DEPC水處理過的玻璃和塑料制品，高溫高壓蒸汽滅菌至少30min。

③玻璃和金屬物品在250℃下烘烤3h以上。

（2）實驗步驟

①勻漿：每50～100mg組織加入1mL TRIzol，用勻漿器進行冰上勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積的10％。

②將勻漿樣品在室溫（15～30℃）放置5～15min，使核酸-蛋白復合物完全分離。

可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)、脂肪、多糖（如肝臟和肌肉中的糖原）或胞外物質(zhì)（肌肉），可于2～8℃12000r/min離心10min，取上清液。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量基因組DNA，上清液中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中進行下一步操作。

③每1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩60s（可使用混勻器，也可手動劇烈顛倒混勻），室溫放置5～15min。

④4℃ 12000r/min離心15min。樣品分為三層：底層為紅色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60％（即1mL最多600μL，為保證RNA質(zhì)量，可適量減少抽取量，防止抽到下層）。

⑤記錄抽取水相的量，把水相轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，用等體積的預冷的異丙醇沉淀水相中的RNA。

a.每使用1mL TRIzol加入0.5mL異丙醇，室溫放置10min。

b.可選：應對糖原含量較高的組織（如肌肉和肝臟），每使用1mL TRIzol在水相中加0.25mL異丙醇和0.25mL高鹽溶液（0.8mol/L檸檬酸鈉和1.2mol/L NaCl）混合離心，這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。

⑥4℃ 10000g離心10min，離心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝臟等富含糖原的組織可能出現(xiàn)大量糖原沉淀），離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)白色半透明狀沉淀。棄上清液。

⑦向1.5mL離心管中加入75％乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1mL TRIzol至少加1mL 75％乙醇。4℃不超過7500g離心5min，棄上清液。

⑧室溫放置于超凈臺通風口（墊上已滅菌的吸水紙）干燥RNA沉淀，晾5～10min即可，過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入適量DEPC水，記錄使用的DEPC水體積（適量是指加入水后仍能保證RNA濃度至少≥0.5μg/μL，但不影響溶解，濃度在4μg/μL以上的RNA較容易出現(xiàn)溶解不完全的情況），使之充分溶解（可選擇4℃放置1h以上或55～65℃水浴10min），之后才可以進行濃度測定、RNA變性電泳等后續(xù)操作，RNA應盡快轉(zhuǎn)移至-70℃保存。

思考題

RNA提取過程中如何防止DNA污染？