第二節　色譜法

1906年俄國植物學家茨維特（Tswett M）所創立的色譜法，是近代有機分析中應用最廣泛的方法之一，既可用于有效地分離復雜混合物，又可以用來純化、鑒定物質，尤其適合于少量物質的分離鑒定。

色譜法是利用混合物中各組分在某一物質中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其他親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經該種物質，進行反復的吸附或分配等作用，從而將各組分分開。流動的混合物溶液稱為流動相；固定的物質稱為固定相（可以是固體或液體）。色譜法從不同的角度分為不同的類型。

（1）按流動相和固定相所處的狀態分類：用氣體作流動相的稱為“氣相色譜”，用液體作流動相的稱為“液相色譜”。由于固定相也可以是液體和固體，因此可按表1-3分類。

①液-液（分配）色譜也包括用化學方法把固定液鍵合在載體表面上的技術。

（2）按固定相的固定方式不同，又可分為柱色譜法（固定相裝在色譜柱中）、紙色譜法（用濾紙上的水分子作固定相）和薄層色譜法（將吸附劑粉末制成薄層作固定相）等。

（3）根據組分在分離過程的作用性質不同，可分為四種類型：吸附色譜法（利用吸附劑表面對不同組分的物理吸附性能的差異進行分離），分配色譜法（利用不同組分在兩相中有不同的分配系數來進行分離），離子交換色譜法（利用離子交換原理進行分離）和排阻色譜法（利用多孔性物質對不同大小分子的排阻作用進行分離）。

本節將扼要敘述柱色譜法、紙色譜法、薄層色譜法和氣相色譜法。

一、柱上吸附色譜法

柱上吸附色譜法的作用原理是：利用混合物中各組分在吸附劑和洗脫劑之間吸附和解吸附能力的差異，將各組分分離。當組分分子到達吸附劑表面時，由于吸附劑表面與組分分子的相互作用，使組分分子在吸附劑表面的濃度增大，這種現象稱為吸附。當洗脫劑連續通過吸附劑表面時，組分分子會被洗脫劑解吸附下來（洗脫劑對組分分子有作用力），在一定溫度下，吸附和解吸附達到平衡。但由于洗脫劑不斷地移動，致使這種吸附與解吸附的過程會反復發生并建立新的平衡，組分分子就隨洗脫劑移動，移動的速度與組分分子的平衡常數（或稱吸附系數）和洗脫劑的流速有關。通過控制流動相（洗脫劑）的流速，各組分就依據其平衡常數的不同而得到分離。方法是將混合物溶于適當溶劑中，使溶液經由填裝有吸附劑的吸附柱中流過，前者稱為流動相，后者稱為固定相。由于各組分被吸附的強弱程度不同，形成一系列色層帶。吸附強的組分留在吸附柱上端，吸附弱的留在下端。在色譜法中常將流動溶液稱為顯層劑或展開劑，溶質移動速率與顯層劑移動速率的比值成為比移值，用Rf來表示：

如果溶質與顯層劑在柱上同時出發移動，那么這個比值也可用在一定時間內兩者移動的距離來表示：

在給定的實驗條件下，Rf值對于某一溶質是一個特征值，因此可借色譜法鑒定物質。被吸附分子與吸附劑間的作用力可能是一種范德華作用力，有時也可能是氫鍵作用。溶質被吸附的強度與它的分子結構有密切關系。一般來說，隨著分子中雙鍵、叁鍵尤其是共軛鍵的增加（如果用的是極性吸附劑），以及分子量的增加，極性增加，吸附能力也將增加。極性官能團的極性按下列次序降低：

芳香烴的吸附能力大于脂肪烴，不飽和烴的吸附能力大于飽和烴。脂肪族化合物被吸附的能力隨碳鏈的增長而增大。在芳香族化合物中，多環芳烴易被吸附，稠環個數愈多，愈易被吸附。

溶質在吸附劑上的吸附與溶劑在吸附劑上的吸附常相競爭。如果顯層劑與吸附劑間的吸附力大于溶質與吸附劑間的吸附力，溶質就不能被吸附而隨著溶劑沖下，這就是“洗提”或“洗脫”。如果情況相反，溶質就被牢固地吸附著而顯出較低的Rf值。溶質、溶劑與吸附劑三者的介電常數、偶極矩、形成氫鍵的能力以及相對極化度決定著這一競爭的結果。

柱上吸附色譜法所用的儀器很簡單，只需要一只適當長度、適當口徑的玻璃管，管下口做一緊縮處及一斜口，再連一個吸濾瓶即可，如圖1-14所示。一般操作步驟是：先在干燥玻璃管中填裝吸附劑（三氧化鋁或硅膠等）。自柱頂端加入待色譜試樣的溶液，然后用原來溶劑或其他適當溶劑沖洗，使之分出色層帶。這一步驟稱為“顯層”。待溶劑前沿達到管底部后，操作停止。各色層的分離一般有以下兩種辦法。①推出法：將吸附劑自吸附管中推出，用小刀將各色層帶切開（如圖1-15所示），分別用適當溶劑提取，濾去吸附劑，將濾液濃縮就可以得到各組分。當用這種辦法分離時，吸附柱玻璃管不能用下口緊縮的，必須用如圖1-16所示的吸附柱裝置，柱長130mm，直徑9mm。②洗提法：待顯層后，用一種極性較強、吸附力較大的溶劑將各組分依次頂替下來，用幾個接收器分別接收流出的各個組分。這一步驟稱為“洗提”，洗提用的溶劑稱為洗提劑。將各份洗提液濃縮即得到各組分。

配制樣品溶液時，最好配成較濃的溶液，這樣顯層的色層帶方能很窄，容易分離清楚。所用的溶劑必須吸附力較弱，使吸附劑能將樣品自溶液中吸附出來。顯層劑的選擇往往憑經驗決定。大致說來，石油醚、二硫化碳、苯、四氯化碳及氯仿代表弱顯層劑；乙醚及異丙醚代表中等強度的顯層劑；低分子量醇及酮代表強顯層劑。吸附力強的顯層劑可用作洗提劑。在嘗試選用未知樣品的洗提劑時，首先用石油醚，其次使用石油醚-苯混合物（混合比例由4:1至1:4），然后依次試用苯、苯-乙醚混合液、乙醚、乙醚-甲醇混合液及甲醇等。有機物自吸附劑上被提取出來的先后次序，隨該物質的化學結構類型而定。有機物的極性愈大，被吸附的強度愈大，洗提出來的次序愈后。洗提出來的先后次序一般是：飽和烴，烯烴，雙烯烴，芳烴，醚，酯，酮，醇，二元醇及羧酸。

吸附劑的選擇也往往憑經驗決定，一種合適的吸附劑應該具備這樣一些條件：①它能夠可逆地吸附待色譜的物質；②它不會引起被吸附物質的化學變化；③它的粒度大小應該能使顯層劑以合適的速率流過（如10～15mm/min）；此外，吸附劑最好是白色或淺色的，以便對色層帶進行觀察。最常用的吸附劑是三氧化鋁和硅膠，它們符合上述要求，并且經過不同處理可以隨意得到不同活度。例如，三氧化鋁可以在不同溫度烘干達到各種不同活度。必須指出，活性大的吸附劑用于色譜法不一定最合適，因為活性太大，物質被吸附得太牢，以致不易被洗提下來。其他較常用的吸附劑有二氧化鎂（用于吸附烴、醇、酮、醚及硝基化物等），碳酸鈣（用于吸附葉色素），硫酸鈣（用于吸附花色甙、維生素K1），氧化鈣、氧化鈦、碳酸鋇、硫酸鎂、無水碳酸鈉（用于吸附葉綠素），滑石粉（用于吸附有機酸、酚類、2，4-二硝基苯腙），硅藻土、蔗糖（用于吸附葉綠素）及淀粉等。許多吸附劑遇水會失去活性，這時只能用無水溶劑。

當進行無色物質的色譜時，可用下面方法來找出色層帶：①將吸附柱系統地切斷，將各段逐一用溶劑洗提，鑒定各洗提液中的物質。②連續地洗提吸附柱，分別用接收器接收一定量的洗提液，然后鑒定各洗提液中的物質。③層吸完畢后，用顯色劑顯色，常用的顯色劑見表1-4。④用紫外線照射，使能發熒光的物質發出熒光。對于不發熒光的物質，可以用發熒光的吸附劑。在普通吸附劑中加入某種能在紫外線照射下發熒光的無機物（如硫酸鋅）或有機染料。該熒光染料以不致降低吸附劑的活性，且在給定的條件下又不會被洗提出者為宜。這時在柱上形成的色層帶相應地改變了吸附劑原來熒光的強度，借這種改變可以了解色層帶的位置。常用的熒光染料如桑色素用于三氧化鋁柱，小檗堿用于硅膠柱，二苯基熒光吲啶磺酸及桑色素用于氧化鎂或氧化鈣柱。⑤制備有色衍生物，然后進行色譜分析。

①表中各顯色劑是在以苯作顯層劑，以硅膠作吸附劑的情況下使用的。各試劑的百分濃度，均為質量分數。

【例1-1】　柱上色譜法分離鄰硝基苯胺、間硝基苯胺與對硝基苯胺（推出法）

分別以苯為溶劑，配置濃度為5mg/mL鄰硝基苯胺、間硝基苯胺與對硝基苯胺溶液。將2mL鄰硝基苯胺、2mL對硝基苯胺及4mL間硝基苯胺溶液混合作為試樣液。取1mL混合試樣液用石油醚（沸程60～70℃）稀釋到5mL，然后進行下述色譜實驗。

取ф18mm×200mm的吸附柱，管底填一小團棉花，然后加入氫氧化鈣吸附劑（自一支寬頸漏斗中加入），邊裝邊敲震吸附柱以裝填密實，無空隙槽溝。填裝至150mm高為止，柱頂蓋以2mm厚的海砂。

將硝基苯胺的苯-石油醚溶液倒入吸附柱中，柱底輕微抽氣。待溶液液面幾乎與海砂齊平時，立刻加入純石油醚作顯層劑。分批加入，務必使在層吸過程中柱頂溶液不要流干。待最底層色層帶距離管底約1cm時，停止層析。令柱干燥，用木杵將吸附劑推出。最上層鮮黃的色層帶是對硝基苯胺（帶寬約20mm）。相距40mm后，中間出現的黃的色層帶是間硝基苯胺（帶寬約25mm），最下層的黃的色層帶是鄰硝基苯胺（帶寬約50mm）。下層與中間層往往靠得很近，有時相距僅5mm，必須仔細觀察，方可以辨別出來。將各色層帶切開分離，用含有10％乙醇的苯或純苯分別萃取。蒸干各萃取液，得到各組分，分別測定熔點。

【例1-2】　柱上色譜法分離芴與芴酮（洗提法）

稱取12.5g氧化鋁。用一支玻塞上未涂潤滑脂的酸式滴定管（50mL）作色譜管，在其中裝入35mL石油醚（沸程40～60℃），將一小團棉花用玻棒推至管底。由一玻璃漏斗向滴定管中裝入1cm厚的海砂，將管輕輕敲震使海砂平整。將氧化鋁倒入管中，注意使氧化鋁裝平裝實。在氧化鋁頂層再蓋一層細砂。打開活塞，令溶劑流出，直到上層砂面之上留有少許溶劑為止。

分別取25mg芴和25mg芴酮溶于少量石油醚中，并倒入柱內。先用石油醚洗提，用預先稱好質量的10mL錐形瓶作為接收瓶，各瓶均編以號碼。每當接收了5～8mL石油醚流出液后更換一只接收瓶。當總共用了20mL石油醚洗提后，或者滴定管尖端不再顯出白色結晶時，表示芴已全部流出，再用苯洗提。這時可以看到芴酮的黃色色層帶逐漸向下移動。待黃色色層帶移近柱底時，再換一只接收瓶。用苯洗提到這一色層帶全部洗下為止。分別濃縮各個級分，可得到純的芴和芴酮，中間混合物級分幾乎沒有。測定產物質量及熔點。芴的熔點為116℃，芴酮的熔點為84℃。

二、柱上離子交換色譜法

離子交換色譜法的原理是：基于溶液中的離子與某種稱為離子交換劑的吸附劑表面的離子之間的相互交換作用。離子交換劑實際上是含有堿性基團或酸性基團的高聚物，如取代酚及氨基酚與甲醛的縮合物、磺化煤或磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸等。離子交換劑分為如下兩類。

①陽離子交換劑：呈酸性，含—SO3H、—CH2SO3H、—COOH或—OH（酚羥基）等酸性基團，具有交換陽離子的能力；

②陰離子交換劑：呈堿性，含—NH2或＝NH 或等堿性基團，具有交換陰離子的能力。

用合成的方法可以得到各種活性不同的離子交換劑，用這些離子交換劑，同時采用不同pH值的溶液，可從混合物中選擇性地提取各種酸、堿或鹽類。

柱上離子交換色譜法儀器裝置與柱上吸附色譜法相似。一支ф50mm具有玻璃活塞的滴定管（酸式滴定管）很適合作離子交換柱。放一小團棉花或玻璃毛在滴定管底部，將離子交換樹脂拌著水分倒入滴定管中，裝填至150～200mm高為止。

離子交換樹脂放入交換柱中后，在任何時候都必須用水浸滿，不使柱內有空氣泡存在。

某些商品陽離子交換樹脂為鈉鹽，稱為Na型。在使用之前，需要用稀鹽酸將它浸泡處理，使之成為游離酸型，然后用蒸餾水淋洗，直到洗下的水液中不含氯離子為止，這時的樹脂稱為H型。一些陰離子交換樹脂是季銨的氯化物，使用之前也需要用堿處理使Cl型轉變為OH型，然后使用。

進行離子交換時，經過下列步驟：①制備交換柱；②進行交換；③洗提，用一種電解質溶液將被阻留在樹脂上的離子頂替下來；④再生，有時這一步與第三步所用電解質相同，有時用其他電解質處理。

每種交換樹脂有一定的交換能力。一般每毫克干樹脂約可交換1～9mmol當量的離子。為了使分離進行得徹底，最好每克樹脂只讓它交換相當于1/2最大交換量的離子。在交換分子量較大的有機離子時，最好選用交換程度較小的交換樹脂。離子交換在工業生產及研究工作中應用極廣。但在有機分析工作中，利用它來分析一般混合物有一定的局限性。這是由于以下幾個原因造成的：①離子交換劑的交換量都很小，在采用實驗室規模數量的交換劑條件下，每次只能分離數毫克的物質，因此只適用于自半微量混合樣品中除去微量雜質，而不適用于分離半微量物質；②在一般操作條件下，只限于使用水溶液（如果將溶液流過交換柱的流速控制得極低，在這種條件下也可以用飽和了的水的乙醚溶液或95％乙醇溶液）；③交換下來的組分存在于極稀的溶液中，用這種極稀的溶液來鑒定或回收待分析的組分是頗為困難的。因此離子交換法最常用的場合是：當所要檢驗的物質已經處于很稀的水溶液中，而沒有更好的分離方法將它分出的時候，所分出的組分需要用微量法來鑒定。

【例1-3】　除去羰基化合物

凡能與亞硫酸氫鈉形成相當穩定的加成產物（α-羥基磺酸鈉）的羰基化合物，都可以借亞硫酸氫鹽型的陰離子交換樹脂的交換作用將它自中性化合物中除去。例如，用這種方法可以自異丙醇中除去丙酮。

準備一支強堿陰離子樹脂柱。令100mL0.5mol/L亞硫酸氫鈉溶液流過交換柱，流速為5mL/min，再用200mL水淋洗交換柱。

將一滴丙酮加入40mL異丙醇及10mL水的混合液中，令該混合液以3mL/min的流速流過交換樹脂柱。丙酮即被樹脂阻留，然后可以用100mL 1mol/L氯化鈉溶液將丙酮洗提下來。要從這么稀的溶液中分離并鑒定原來的丙酮是頗為困難的，極小心地按下述步驟尚可達到這一目的：將洗提液用氯化鈉飽和，蒸出1mL，最后用這1mL的丙酮溶液制取其2，4-二硝基苯腙衍生物來加以鑒定。

【例1-4】　除去陽離子

從有機物水溶液中除去陽離子，可以借將試液通過強酸性陽離子交換樹脂的辦法來達到目的。

在交換柱中放入強酸性陽離子交換樹脂，裝填至20cm的高度。以100mL 10％鹽酸流過樹脂。用水淋洗交換柱，直到流出液對甲基橙呈中性反應為止。

取10～15mg氯化鐵溶于適量的95％乙醇中。用所得溶液流過交換柱，流速約2～3mL/min。流畢，用50mL蒸餾水淋洗交換柱，鐵離子將被樹脂阻留。

三、紙上色譜法

紙上色譜法是以紙作為載體的色譜法，屬于分配色譜。其原理是：利用混合物中各組分在兩種互不相溶的液相間的分配系數不同，進行各組分的分離。它所使用的固定相一般為紙纖維（由幾個葡萄糖分子組成的大分子，其中含有多個親水性羥基，能與水分子形成氫鍵）吸附的水（或水溶液），而流動相為與水不相溶的有機溶劑。當被測組分在兩相之間進行分配時，由于各組分分配系數的不同得到分離。分配色譜的方法原則上與液-液連續萃取方法相同。大致說來，如果溶質在流動相中的溶解度高，它將移動得快些，因而有較高的Rf值；反之，溶質在流動相中的溶解度低，而在固定相中的溶解度高，則它會移動得慢些，因而有較低的Rf值。由此可見，凡影響溶質在兩個液相中溶解度的各種因素，都會影響分析時的Rf值。

紙上色譜法的操作是：取一根在展開溶劑的蒸氣中放置過夜的長條濾紙，在濾紙下端2～3cm處用鉛筆劃好起始線，然后將要分離的樣品溶液用毛細管點在起始線上，待樣品溶劑揮發后，將濾紙的上端懸掛在展開槽的支架上，使濾紙的下端浸入一盛有展開劑的淺皿中，展開劑由于毛細管作用沿紙條上升。當展開劑前沿升到接近濾紙上端時，取下濾紙，記下溶劑前沿位置，使之干燥。如果被分離物中各組分是有顏色的，則濾紙條上就有各種顏色的斑點顯出。較常見的情況是被分離物中各組分是無色的，這時待濾紙條干燥后，于紙上噴以顯色劑而使各組分化合物的斑點呈現，這種操作方式稱作上升紙上色譜法，一般裝置如圖1-17（a）所示。如果將要分離的樣品溶液滴在濾紙條的上端，將濾紙條的上端浸入展開劑中，溶液便由濾紙的上端向下方移動，裝置如圖1-17（b）所示，這種方法稱作下降紙上色譜法。上升法一般需要時間較長，但溶質在兩相中的分配較易達到平衡，產生的斑點面緊湊圓整，組分易于分開。下降法則快些，省時間，對于容易分離的混合物最好用下降法。

上述兩種方法都是所謂單相色譜法。如果這種色譜在一張方形濾紙上進行，當色譜完畢，斑點出現情況如圖1-18所示。如果將濾紙A邊再浸入到一新溶劑中進行第二次展開（自A邊移向B邊），那么形成的色層稱為雙相色譜法。雙相色譜法的意義很明顯，如果圖1-18中四個斑點中某一點中含有兩個組分，由于它們在第一種展開劑中有相近的Rf值，那么在第二種展開劑中它們兩者的Rf值可能不同，因而在第二次色譜時顯出兩個斑點，如圖1-19所示。由第二次色譜結果可知道1、2、4三個點確實是代表著兩個組分，斑點3可能代表一個組分或者也可能代表在兩種展開劑中都有相同Rf值的兩個組分。后一種可能性雖然很小，但也應加以考慮。

紙上色譜法的Rf值通常受到下列因素的影響：①紙的質量；②溫度；③樣品的取樣量；④展開溶劑；⑤試樣原點與溶劑面之間的距離。

利用紙上色譜法的Rf值作為鑒定有機化合物的憑據時，最好用已知標準樣品在相同實驗條件下，平行對照進行色譜，如果兩者Rf值相同，方可斷定是同一物質。

為了使紙上色譜法得到正確結果必須注意下列事項：①不要用手指直接接觸色譜部分的濾紙，以防手上油脂污染濾紙；②濾紙條必須剪平整；③濾紙周圍必須用溶劑蒸氣所飽和，否則就有可能當顯層劑達到紙上某一處時，它的蒸發速度大于毛細管汲引速度，致使已經分開的各組分重新又在這里聚集，隨溶劑蒸氣壓的大小和色譜容器的大小不同，使容器中飽和地充滿溶劑蒸氣的時間可以從幾分鐘至數小時；④所用有機溶劑一般需事先用水飽和，以便當它在濾紙上移動時，有足夠的水分供濾紙吸附，不過溶劑中水的含量不能太多，否則色譜時不能得到良好的分離，一般溶劑含水量不超過10％～20％（質量分數）；⑤用蒸氣壓太低的溶劑有時不合適，因為它們很難干燥除去，以致影響顯色反應。采用蒸氣壓太高的溶劑要注意它們對溫度的變化很敏感，容易在紙上蒸發逸去或凝集，以致當溫度控制不夠嚴格時，往往引起液相的不規則變化。

進行紙上色譜法時往往采用混合溶劑作為展開劑。表1-5中列舉了一些有機化合物進行紙上色譜法分析所常用的展開劑和顯色劑。

除了上述裝置外，還可以用圓形濾紙作紙上色譜分析。取一張圓形濾紙架在直徑比它略小的培養皿上，皿中盛顯層溶劑。將濾紙自中心剪出一條向下彎折，使這小條濾紙浸入顯層劑中（或者在濾紙中心穿一孔，塞入一小卷濾紙作芯），在接近中心處滴一滴試液。將整個儀器盛于一較大培養皿中，蓋好。令靜置進行色譜。在這種情況下，各組分顯層后呈同心圓狀層帶（圖1-20），而不是如長條濾紙上色譜那樣呈斑點狀。為了利用紙上色譜法原理分離較大量的物質，可將濾紙漿填裝入玻璃管中，如柱上吸附色譜法那樣進行柱上分配色譜分離。

四、薄層色譜法

薄層色譜法是一種在鋪成薄層固體上進行色譜的方法。兼備柱色譜和紙色譜的優點。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面在制作薄層的時候，把吸附層加厚，將樣品點成一條線，則可分離多達500mg的樣品。此法特別適合揮發性小或在高溫下易發生變化而不能用氣相色譜分析的物質。一般能用薄層色譜分開的物質也能用柱色譜分開，故薄層色譜常用作柱色譜的先導。

正如經典柱色譜法一樣，可以有三種形式：①吸附色譜；②分配色譜；③離子交換色譜。其中應用最廣泛的是吸附薄層色譜，這里只討論它。

當溶液中某組分的分子在運動中碰到一個固體表面時，分子會貼在固體表面上，這就是發生了吸附作用。一般說來，任何一種固體表面都有一定程度的吸附力。這是因為固體表面上的質點（離子或原子）和內部質點的處境不同。在內部的質點間的相互作用力是對稱的，其力場是相互抵消的。處在固體表面的質點，所受的力是不對稱的。其向內的一面受到固體內部質點的作用力大，表面層所受的作用力小，于是產生固體表面的剩余作用力。這就是固體吸附溶液組分分子的原因，也就是吸附作用的實質。

在吸附色譜過程中，溶質、溶劑和吸附劑三者是相互聯系又相互競爭的，構成了色譜分離過程。

在吸附薄層色譜過程中，主要發生物理吸附。當固體吸附劑與多元組分溶液接觸時，一方面任何溶質都可被吸附（當然單位質量吸附劑所能吸附物質的量，即“吸附量”會因物而異）；另一方面，吸附劑既可吸附溶質分子也可吸附溶劑分子。由于吸附過程是可逆的，因此，被吸附了的物質在一定條件下可以被解吸下來，而解吸也是具有普遍性的。

在吸附薄層色譜過程中，展開劑（溶劑）是不斷供給的，所以在原點上溶質與展開劑之間的平衡不斷地遭到破壞，即吸附在原點上的物質不斷地被解吸。解吸下來的物質溶解于展開劑中并隨之向前移動，遇到新的吸附劑表面，物質和展開劑又會部分地被吸附而建立暫時的平衡，但立即又受到不斷移動上來的展開劑的破壞，因而又有一部分物質解吸并隨展開劑向前移動，如此吸附-解吸-吸附的交替過程而構成了吸附色譜法的分離基礎。吸附力弱的組分，先被展開劑解吸下來，推向前去，故有較高的Rf值，吸附力強的組分，被扣留下來，解吸較慢，被推移不遠，因此Rf值較低。

在吸附薄層色譜中所用的吸附劑主要是硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，它們的分子中都含有未公用電子的氧原子或氮原子和能形成氫鍵的—OH或—NH基團。

被吸附物與吸附劑之間的作用力包括色散力、靜電力、誘導力和氫鍵作用力。前三者即一般所謂的范德華力。在非極性和弱極性之間，由于分子內電子運動所產生的瞬時偶極而引起的作用力叫色散力。極性吸附劑與極性吸附分子偶極之間的作用力主要是靜電力。被吸附的物質的極性越大，與極性吸附劑的作用越強。在極性吸附劑表面與非極性的被吸附物之間相互作用，使非極性分子產生偶極而吸附在吸附劑表面上，這種作用力就是誘導力。氫鍵作用力，X—H…Y是一種特殊的范德華引力，其與范德華力的不同之處在于它具有方向性和飽和性。X，Y表示電負性很大的原子，例如，F、O、N。X與H間以極性共價鍵相連，H…Y間是表示氫鍵。氫鍵的強弱和X、Y的電負性大小有關，也與Y原子的半徑有關。Y的電負性越大，半徑越小，氫鍵越強。碳原子電負性小不能形成氫鍵，因此烴類與吸附劑之間不能形成氫鍵。這四種作用力的強弱次序是：

氫鍵作用力>靜電力>誘導力>色散力

因而在各類有機化合物中，飽和烴的吸附力最小，如果分子中含有某些官能團，例如，—NO2，—COOR，—CHO，—OH，—COOH，—NH2，＝NH，常有顯著的氫鍵作用力存在，則吸附力增大。由實驗結果得知，含單官能團的有機化合物與硅膠或氧化鋁親和力大小次序如下：

羧酸>醇、酰胺>伯胺>酯、醛、酮>腈、叔胺、硝基化合物>醚>烯>鹵代烴>烷；分子中雙鍵數目增加，親和力也增加，特別是雙鍵處于共軛時更是如此；芳環的影響比雙鍵大；芳香化合物隨著環的數目增加，吸附親和力增大；同系物中，分子量越大，吸附力也越大。

分子中極性官能團數目增多，一般情況下吸附親和力增加。但若兩個官能團處于鄰位而能發生分子內氫鍵締合時，則將使它們與吸附劑形成氫鍵的力量削弱。其吸附親和力將小于不發生分子內氫鍵締合的位置異構體，如：

在薄層色譜中，就是憑借上述基本概念來選擇吸附劑、展開劑和估定Rf值順序的。這個規律在下面的氣相色譜法中也同樣適用。

制備薄層色譜板一般適用于分離幾十毫克至幾百毫克的樣品。當然，在多塊薄層板上進行重復分離也可制備更大量的純化合物。薄層色譜比柱上色譜分析較迅速，并且分離效果較佳。

為了增加每塊板的載量，薄層可厚一些，一般在0.5～2mm之間。更厚的薄層只適用于Rf值具明顯差異的物質的粗略分離。制備薄層板的尺寸一般是20cm×20cm或20cm×40cm。

樣品溶液的濃度一般在5％～10％，在20cm×20cm×0.5mm的薄層上分離樣品一般為10～50mg，有時可達100mg。為了分離較大量的樣品，可用許多塊薄層板分離。例如，有資料介紹曾用150塊20cm×20cm的薄層板分離了15g物質。

硅膠是無定形多孔性物質，略具酸性，適用于酸性物質的分離分析。薄層色譜用的硅膠分為“硅膠H”——不含黏合劑；“硅膠G”——含煅石膏黏合劑；“硅膠HF254”——含熒光物質，可在波長254nm紫外線下觀察到熒光信號；“硅膠GF254”——既含煅石膏黏合劑又含熒光劑等類型。

與硅膠相似，氧化鋁也因含黏合劑或熒光劑而分為氧化鋁G、氧化鋁GF254及氧化鋁HF254等。

黏合劑除了用上述煅石膏（2CaSO4·H2O）外，還可用淀粉、羧甲基纖維素鈉。通常將薄層板按加黏合劑和不加黏合劑分為兩種，加黏合劑的薄層板稱為硬板，不加黏合劑的稱為軟板。

薄層板制備的好壞直接影響色譜的效果。薄層板應盡量均勻且厚度（0.15～1mm）固定。否則展開式溶劑前沿不齊，色譜結果也不容易重復。

薄層板分為干板和濕板。濕板的制法有以下兩種。

①平鋪法：用商品或自制的薄層涂布器（圖1-21）進行制版，它適合科研工作中數量較大要求較高的需要。如無涂布器，可將調好的吸附劑平鋪在玻璃板上，也可得到厚度均勻的薄層板。②浸漬法：把兩塊玻璃片背靠背緊貼，侵入調制好的吸附劑中，取出后分開、晾干。

把涂好的薄層板置于室溫晾干后，放入烘箱內加熱活化，活化條件根據需要而定。硅膠板一般在烘箱中漸漸升溫，維持105～110℃下活化30min。氧化鋁板在200℃烘4h可得活性Ⅱ級的薄層，150～160℃烘4h可得活性Ⅲ～Ⅳ級的薄層。薄層板的活性與含水量有關，其活性隨含水量的增加而下降。

氧化鋁板活性的測定：將偶氮苯30mg，對甲氧基偶氮苯、蘇丹黃、蘇丹紅和對氨基偶氮苯各20mg，溶于50mL無水四氯化碳中，取0.02mL此溶液滴于氧化鋁薄層上，用無水四氯化碳展開，測定各染料的位置，算出Rf值，根據表1-6中列出的各染料的Rf確定其活性。

硅膠板活性的測定類似：取對二甲氨基偶氮苯、靛酚藍和蘇丹紅三種染料各10mg，溶于1mL氯仿中，將此混合液點于薄層上，用正己烷-乙酸乙酯（9:1，體積比）展開。若能將三種染料分開，并且Rf值二甲氨基偶氮苯>靛酚藍>蘇丹紅，則與Ⅱ級氧化鋁的活性相當。

為了避免樣品在薄層上由于擴散而增寬，最好采用揮發性的非極性溶劑配制樣品溶液。在距薄層板底邊1.5cm處滴加樣品溶液，有的點成虛線，有的點成直線。最簡單的辦法是用一毛細移液管或滴管沿著一把不銹鋼尺直接點樣可得到滿意結果。如果一次點不完，必須分幾次點樣時，在每次點樣后要用吹風機吹干前次所點樣品，才能加入第二次，以防樣點過大，造成拖尾、擴散等現象，影響分離效果。也可以用一排毛細管點樣，所用毛細管要挑選內徑一致的、筆直的，固定在硬紙板上。每條毛細管與相鄰毛細管之間用一條較短的毛細管隔開。也有介紹用刀片將薄層的預定點樣位置上劃兩條細縫線，彼此相距3mm，切成3mm寬的槽帶。把樣品溶液注于此槽帶上，投料完畢，用干的吸附劑填滿細縫，如圖1-22所示，再進行展開。

為了獲得狹窄整齊的點樣帶，有時在點樣后展開分離之前，先用極性較大的溶液將全部樣品齊頭推進一個短距離（大約在原來起始線之上1cm處），使成一條整齊狹窄的新的點樣線，晾干后，再換適當的展開劑進行展開。薄層色譜的展開，需要在密閉容器進行，常用的展開槽有：長方形盒式和廣口瓶式（圖1-23），展開方式有以下幾種。

①上升法：用于含黏合劑的薄層板，將薄層板垂直置于有展開劑的容器中。

②傾斜上升法：薄層板傾斜15°［圖1-23（a）］，用于無黏合劑的軟板，含黏合劑的色譜版可傾斜45～60°。

③下降法（圖1-24）：展開劑放在圓底燒瓶中，用濾紙或紗布將展開劑吸到薄層板的上端，使展開劑沿板下行，這種展開的方法適合Rf值小的化合物。

分離后，通常通過顯色法確定被分離物質的所在位置。如果物質是有色的或發出熒光的，或能吸收紫外線的，色帶的定位就比較簡單。對于無色化合物可用桑色素制成熒光板，展開后再于紫外線燈下檢出該物質的位置，洗脫時要把桑色素棄去。方法是在小色譜管中先裝入約1cm厚的活性氧化鋁，桑色素與氧化鋁形成螯環化合物而被牢固吸附住，然后用適當溶劑將所需要化合物淋洗下來。當然，若用氧化鋁薄層板，此步驟可以省去。用紫外線，特別是短波紫外線照射薄層時要注意有可能使化合物分解或異構化等。

無色化合物也可以用參比色譜定位。在展開后的薄層兩側距邊緣0.8～1cm處用刮刀小心切割一條直線。將薄層的中間部分用另一玻板嚴密蓋好，僅留邊緣的窄條進行顯色。然后將中間的部分在相應的位置作出記號。把兩側參比部分用刮刀或硬橡皮刮鏟干凈，再用棉花揩凈不留下污染的粉末。

在大多數情況下，可以用碘蒸氣定位。顯色后作出色帶記號，然后將色譜板置于空氣中令碘揮發逸去。但要注意有些化合物如不飽和烴、苯酚類，與碘易發生反應，不能用此法定位。親脂性化合物可以由噴水檢出，這是由于吸附劑與親脂性物質有不同的潤濕性，噴水后，整片薄板潤濕并呈半透明狀，親脂性物質則在半透明背景上呈現白色不潤濕點（帶）。在透射光下較易觀察，但靈敏度不高。

如果是硬板，按所標記位置刮下帶有樣品的吸附劑，放在小色譜管或離心管中，進行洗脫。如果是軟板，可利用減壓抽吸，將被分離物質連同吸附劑抽吸到小色譜管中（見圖1-25），然后用溶劑洗脫。為了使過濾或洗脫過程順利進行，應避免使用顆粒過于細小的吸附劑。為了減少吸附劑所含雜質的污染，最好將硅膠或氧化鋁吸附劑事先在抽提器中用甲醇抽提8h。由制備薄層色譜法所分離得到的物質通常還要經重結晶或蒸餾一次，以保證其中不含吸附劑及其他雜質。

【例1-5】　在顯微鏡載片上進行薄層色譜

用顯微鏡載片作基片制備薄層（硅膠G）板，臨用前在105℃烘10min活化。取出，在干燥器中冷卻。距一端邊0.5cm處刻劃一線作頂線，距此線6cm處再劃一線作點樣起始線。取一底徑8～10cm，高2.5cm的玻璃培養皿作色譜缸，內盛4mL展開劑，搖動20s使蒸氣飽和。將點好樣的薄層板放入，蓋好。當展開劑升至頂線，取出薄層板，晾干。用下述的染料顯色，酚類則用0.2％ 2，7-二氯熒光素醇溶液噴灑顯色，在紫外線照射下，各類酚在黃色熒光背景下顯示紫色斑點，結果見表1-7。

五、氣相色譜法

色譜法的分離原理是：使混合物中各組分在固定相和流動相間進行交換。由于各組分在性質上和結構上的不相同，當它們被流動相推動經過固定相時，與固定相發生相互作用的大小、強弱會有差異，以致各組分在固定相中的滯留時間有長有短，而按順序流出，達到分離的目的。

當氣體作為流動相時，稱為氣相色譜。在氣相色譜中，固定相有兩類。如果固定相是一種活性固體，即吸附劑，稱這類固定相的氣相色譜法為氣固色譜法（簡稱GSC）；如果固定相是附著在惰性固體上的液體（或稱固定液），用這類固定相的氣相色譜法稱為氣液色譜法（簡稱GLC）。在GLC中，混合試樣各組分根據在固定液中的溶解度不同而進行分離。在固定液中溶解度小的組分會較快地被流動相（載氣）帶出色譜柱。因載氣流是連續地流過色譜柱，溶解在固定液中的分子會與新過來的載氣相互平衡，氣相中的組分被載氣流帶入一段新的固定液中，以便達到再平衡。樣品中各組分在固定液和流動的氣相中進進出出反復多次再平衡就是氣液色譜過程的基本機理。常用的固定液是難揮發的有機化合物，它們在常溫下是液體或固體，在工作溫度下是液體。將它們涂漬在惰性固體，如耐火磚粉末、硅藻土粉末的表面上，填裝入色譜柱，形成固定相。

在GSC中，基本機理與GLC是相似的，也是混合物試樣中各組分在氣相與固相間發生反復多次再平衡而達到分離的目的。但不是根據溶解度的差別，而是根據各組分在作為固定相的吸附劑上被吸附的強弱不同導致分離。常用的吸附劑有硅膠、活性炭和分子篩等。這種色譜柱主要用來分離永久性氣體及揮發性碳氫化合物。

（一）定性分析

1.根據保留值定性

各種物質在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可以作為一種定性指標，正如在紙上色譜法或薄層色譜法利用Rf值作為定性指標相似。在氣相色譜中，根據保留值定性有下列幾種方式。

（1）利用相對保留值定性：選用某種化合物作為標準物質，把它的保留值當成1，然后求出在同一條件下未知物與標準物質的保留值的比值α，即相對保留值：

式中，i、s分別表示測定物質和標準物質；為調整保留時間；為調整保留體積。相對保留值受固定液用量和操作條件影響較小，作為定性指標，比保留值本身較為可靠。

測出了未知峰的α值后，根據未知物的來源及性質等估計出它可能是哪種化合物，取這個“可能化合物”的純品，在相同條件下也求出相應α值。若這α值與未知樣品的相同，證明對未知物的判斷不錯。

當操作條件不易控制穩定和相鄰物質的保留值較接近時，準確測定保留值有困難。在這種情況下可以取“可能化合物”的純品直接加入分析樣品中進行色譜分析，若相應的色譜峰增高，而半峰寬不相應增加，那么推證未知樣品就是這個“可能化合物”。

（2）利用保留值與碳數或沸點變化規律定性：若找不到“可能化合物”的純品與未知物進行上述對比實驗時，可以根據同系物間保留值與碳數或沸點的經驗規律進行定性。

實驗證明，許多類型化合物的同系物中各組分的保留值的對數與碳數或沸點呈線性關系，即：

lgZ=a1+b1Nc　　（1-4）

lgZ=a2+b2Tb　　（1-5）

式中，Nc和Tb分別為碳數和沸點；a1、a2、b1及b2為經驗常數；Z為保留值的一般形式（它可能是調整保留體積、相對保留值或比保留體積等）。

實際操作是：先取幾個能夠得到的同系物進行色譜實驗，根據所測得Z值及Nc或Tb劃出直線圖，或者求出上列式中的a1、a2、b1、b2值。將未知化合物在同樣條件下進行色譜分析，求出其相應Z值，然后對照直線圖或代入上列式中求出其碳數、或沸點，即可推知其為何物。

（3）利用多柱定性：同系物在一種固定相上的保留值與在另一種固定相上的保留值呈線性關系，即：

lgZ1=a3+b3logZ2　　（1-6）

式中，Z1和Z2分別為在第1號及第2號色譜柱上測得的保留值；a3、b3為經驗數值。如果未知物與“可能化合物”在兩種不同極性的色譜柱上所測得的相應保留值都一致時，則二者是同一物質的可靠性較用一種固定相測得者大得多。

（4）用在不同柱溫下保留值定性：在同一色譜柱上，物質的保留值的對數與柱溫（絕對溫度）的倒數成直線關系，可以利用這一經驗規律進行未知物的定性，即：

式中，Z為保留值的一般形式；a4、b4為經驗常數；Tc為柱溫的絕對溫度數值。

2.應用化學反應定性

（1）制備衍生物定性：若色譜分析中一未知組分的保留值與一個“可能化合物”純品在同樣條件下測得的相應保留值相同時，兩者可能為同一物質。為了確證起見，可將兩者制成相同的衍生物，將這些衍生物分別測其保留值，若二者又一致時，就能更可靠地推證未知物與“可能化合物”為同一物質。

一般難揮發的組分往往制成它們的揮發性衍生物進行色譜分析，各類化合物的常用衍生物列于表1-8中。

制備衍生物，不只是為了定性，還有下面的目的：一些難以揮發的高級醇（如甾醇、糖類）、氨基酸、羧酸以及胺類，本身很難用氣相色譜進行分析，若制成揮發性衍生物，如三甲基硅醚、醛、甲酯及三氟乙酰胺等，則色譜分析得以順利進行；此外，對于一些不含電負性基團，因而不便于用高靈敏度的電子俘獲檢測器進行氣相色譜痕量分析的化合物，若事先制備成含氟、含氯或硝基的衍生物，即可克服此困難。

利用衍生物保留值來進行定性鑒定時，必須事先知道化合物中所含有的官能團。所制成的衍生物一般是：熱穩定性好，揮發度高，產量高，過量試劑與可能的副反應產物不干擾測定（因反應產物一般不再進行分離，反應后直接注入色譜柱進行分析），其保留值與原來化合物保留值應相差大。將未知物轉化為衍生物的反應可在色譜以外單獨進行，也可在注射器針筒內、柱前微型反應器內或直接在色譜柱中進行。

（2）扣除法定性：利用官能團特征反應，使未知樣品與某一試劑反應后生成不揮發衍生物而被扣留，于是色譜圖中相應峰的被消除得以鑒定原來組分屬何種類型的化合物。

扣除法可以用三種形式進行：①將扣除劑涂浸在載體上填充于一段柱內，這種柱可裝在色譜柱前，也可裝在柱后，同時進行空白對照，如圖1-26所示；②用注射器的芯蘸取少量扣除試劑，然后用這個注射器抽取試樣，針頭部分的氣樣也要抽入針筒內，將針頭插在進樣橡膠墊上進行封閉，放置足夠時間，把樣品注進色譜柱；另取一注射器，不蘸扣除試劑，抽取氣樣進行空白對照分析；③對于反應慢的扣除劑可在色譜柱外在毛細管中與試樣混合，封閉加熱一定時間后，再用微量注射器抽取試樣進行色譜分析。最后一種方式較少采用。

各種扣除試劑列于表1-9中。從表1-9中可以看出，為了扣除某一類化合物，除了采用化學試劑外，也可以用吸附劑如分子篩等扣留。在應用這些方法前最好用已知化合物先進行核驗。扣除法定性示例見圖1-27。

（3）官能團特征反應定性：在色譜柱通過T型三路管，將一部分流出物通往檢測器，一部分流出物通入微型試管，內盛官能團檢驗試劑。由官能團特征反應的顯色或產生沉淀，對未知峰作初步鑒定，判斷其中含有哪種官能團，為進一步確證提供參考。由于官能團反應靈敏度不是很高，這個方法所需試劑較多。裝置如圖1-28所示。

3.與其他儀器聯用定性

氣相色譜是極有效的分離工具，但在定性方法上有較大的局限性；而波譜法（紫外、紅外、核磁、質譜及拉曼光譜等）是鑒定單純有機化合物或進行結構剖析的強有力的工具，但波譜法分析復雜混合物又有一定的局限性。如果將氣相色譜法與波譜法聯用起來，可以互相取長補短，相得益彰。這是目前色譜法發展的方向之一。

與氣相色譜儀直接聯用的儀器必須具有兩個條件：①其靈敏度必須足以鑒定經色譜柱分離的極微量組分；②必須具有快速掃描裝置以適應從色譜柱分離出各組分的速度。

在這些聯用技術中以氣相色譜和質譜聯用（簡稱色-質聯用技術）發展得最為迅速，應用也最廣泛。色-質儀器已是現代有機化學實驗室中鑒定復雜多組分混合物不可缺少的工具。

除色-質聯用外，氣相色譜與紅外光譜聯用技術的迅速發展也是非常引人注目的。

（二）定量分析

用微分型檢測器，每個組分的信號-峰高或峰面積可按下式換算成物質的質量：

h×f=m　　（1-8）

或　　A×f=m　　（1-9）

式中，h代表峰高；A代表峰面積；m表示物質的質量（g）；f稱為定量校正因子。

氣相色譜定量時，首先要準確量出峰高或峰面積，其次要準確求出定量校正因子，然后計算物質的含量。

1.峰面積的測量

若色譜峰形尖窄對稱，半峰寬不變，可由峰高定量，這時測量峰高是比較簡單的。但是在大多數情況下，峰形較寬或呈扁寬形，若用峰高定量，誤差較大，必須用峰面積定量。峰面積的測量比較復雜，常用的方法可分為兩大類：自動測量法和手工測量法。前一類最重要的是電子計算機法，后一類較常用的是幾何圖解法、剪紙稱重法或機械積分儀法等。

計算機引用到氣相色譜中，即能快速處理色譜分離所提供的數據，又使整個色譜分析過程自動化，從而可使監視控制生產自動化。計算機處理色譜數據還有下面特點：①不需要用手工確定峰的起點和終點；②自動補償基線漂移；③免除大峰小峰并存時經常調衰減的麻煩；④遇到疑難峰能將保留值打印出來。另外除了具有處理數據的功能外，還有檢查文獻、儲存數據、總結實驗規律等能力。

在幾種手工測量峰面積的方法中，實驗室應用最多的是幾何圖解法。峰面積等于峰高（h）與半峰寬（W1/2）乘積的1.065倍，即：

A=1.065×h×W1/2　　（1-10）

因此，可用峰高乘半峰寬法來代替實際峰面積作定量計算。

在用峰面積進行定量分析時，須注意下列兩個經常遇到的問題。

①基線漂移：在手工測量中，扣除基線漂移的方法是將峰起點和終點間的聯線當作峰底，從頂對時間軸作垂線，對應的時間即保留時間，垂線在峰頂至峰底間的一段即峰高，如圖1-29所示。對于未完全分離的峰，不能逐個劃出基線時，可根據出峰前和出峰后的總基線來決定峰高，如圖1-30所示。

②未完全分離峰的測量：通常采用經驗方法。例如：a.峰形對稱，交疊不多時，從峰谷向基線作垂線，以這條線作為兩峰的交界線，分別計算峰面積，如圖1-31（a）所示。b.峰形對稱，交疊嚴重時，可在峰的轉折點畫切線與基線相交，構成如圖1-31（b）所示的三角形ABC和DEF，然后測量這個三角形的面積。c.當小峰落在主峰一側時，沿著主峰的尾部作平滑線畫出小峰的基線，用面積計測出小峰的面積，如圖1-31（c）所示。

2.定量校正因子

定量校正因子最好是在具體分析條件下用純物質求出。如果沒有純物質時則引用文獻上總結的一些校正因子。為了克服實驗條件的影響，通常采用相對校正因子，即以一個標準物的校正因子定為1，在同樣條件測得分析樣品化合物校正因子與標準物的比值。相對校正因子有兩種：相對質量校正因子（RWR）和相對物質的量校正因子（RMR）。不同的檢測器測出的校正因子不同。

3.百分含量的計算

（1）歸一化法：當進樣量無法進行精確測量，而樣品中所有組分全部出峰時，各組分的百分含量按下式計算：

如果組分含量在鑒定器線性范圍內變化，半峰寬不隨進樣量變化，可直接用峰高計算，上式變為：

【例1-6】　測混合一元苯羧酸

色譜條件：固定相：1，2，3，4-四氰乙氧基丁烷涂浸于6201擔體（液/擔=5％）

柱：不銹鋼ф4mm×3000mm

柱溫：125℃

載氣：H2，60mL/min，表壓176.5kPa

檢測器：熱導池，橋流150mA，125℃

氣化室溫：250℃

操作：將試樣用重氮甲烷乙醚溶液在室溫甲酯化。反應完畢，溫水浴中除去過量試劑（通風櫥中進行）。然后將甲酯溶于氯仿中進行氣相色譜分析。

測相對校正因子：以聯苯作標準物，取0.5000g放入25mL容量瓶中，用氯仿溶解并稀釋至刻度。

準確稱取20mg對甲苯甲酸放入小試管中，用吸量管準確加入1.5mL內標溶液（共含聯苯30mg），溶解后取2μL進行色譜分析，測得峰面積數據如下：

相對質量校正因子：

測若干次測得的平均值。

若已知試樣中同時含對、鄰、間甲基苯甲酸及苯甲酸，并且全部在色譜圖上出峰，除了求出對甲基苯甲酸的相對重量校正因子外，還必須求出其余三種羧酸的f'。設求出值為：

樣品分析：樣品經甲酯化后溶于適量氯仿中，注入色譜柱，由色譜圖中求得各峰面積為：

則可求得：

其他苯羧酸含量可以類似方法求得。

（2）內標法：此法是把已知量的內標物加入到已知質量的分析樣品中，根據已知量的內標物的峰面積和樣品待測組分的峰面積來計算組分的百分含量。

選擇內標物的條件是：①內標物的流出時間最好與樣品中所存在的組分流出時間不重疊；②內標物色譜峰位于各組分流出峰的中間位置，距離待測組分不太遠；③性質盡可能與待測組分接近。

此方法與上述方法比較有下面優點：不要求全部組分在色譜圖上都出峰，也不必將各組分的定量校正因子都求出來；缺點是每次必須事先精確稱量內標物和試樣，較麻煩。

計算方法如下：

設質量mg的混合試樣中待測組分的質量為mig，若在混合試樣中加入msg的內標物，它們之間存在下列關系（設待測組分百分含量為Xi％）：

由于待測組分與內標物質量之比等于峰面積之比，可知：

將式（1-14）及式（1-13），整理可得：

【例1-7】　設在【例1-6】中，精確稱取50.0mg試樣放入小試管中，精確加入0.3mL聯苯標準溶液（濃度為20.0mg/mL），加2mL重氮甲烷乙醚飽和溶液，甲酯化后，蒸去乙醚，加入適量氯仿溶解后，將溶液注入色譜柱進行分析，色譜條件如前，測得色譜峰面積為：

則

（3）外標法（已知樣品校正法）：這個方法的原理是：配制已知濃度的標準樣（即待測組分的純樣品）溶液進行色譜分析，測出各不同溶液標樣的峰面積，求出單位面積的相應含量，取其平均值k；或者以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。然后在與標樣實驗嚴格相同的條件下，進入一定量的試樣，求出其色譜峰面積，參照標準曲線或根據k值計算，可求得待測組分的百分含量。

與上兩種方法比較起來，本法操作簡便，因此生產上樂于采用。但它要求樣品分析條件必須與標樣實驗嚴格相同；并且要求進樣量準確。對于氣體樣品用定量管進樣容易做到重現性好，對于液體樣品，進樣重復性存在一定困難。

校正值法由下式計算：　Xi％=ki×Ai×100％式中，ki為i組分的校正值，即單位峰面積相當于i組分在樣品中的百分含量。

如果樣品中各組分濃度變化范圍不大，可以配一個與樣品含量相當的已知混合樣品，定量進樣后由所得相應的峰面積和已知的樣品組分的含量即可算出ki。因為原則上ki不應隨進樣量而變化，所以，可以只作一個濃度求出ki，即所謂單點校正法。

但是如果樣品濃度變化范圍很大，則需預先配制一系列的已知標準樣畫出如圖1-32所示的濃度與對應峰面積的標準曲線，驗證樣品濃度與對應峰面積的線性范圍。若在實驗條件下存在線性關系，那么分析時直接根據峰面積查圖便可得出各組分的濃度，或者測一系列濃度下的校正值的平均值作為ki值按前式進行計算。

外標法雖然簡單方便，特別適于工廠生產中的控制分析，但必須注意分析時操作條件要求很穩定，因為它不像歸一化法或內標法色譜操作條件的影響可以有所抵消，因此經常需要用標準樣品進行k值或標準曲線的校驗。影響分析結果的操作因素有載氣流速、柱溫、氣化室溫度、熱導檢測器的橋流等。

（三）反應氣相色譜法在測定有機物結構方面的應用

反應氣相色譜法指微型化學反應器與氣相色譜聯用的技術，微型反應器可連在柱前或柱后，或與色譜柱混合為一。反應氣相色譜法可克服經典色譜法的不足，例如：①經化學反應使熱不穩定或難揮發的物質在柱前轉化為熱穩定易揮發的產物后進行分析；②用熱導池作鑒定器時，在柱后經化學反應轉變為同一產物進行檢測，以避免各組分逐一測其應答值的麻煩；③對不適用高靈敏度檢測器的化合物，柱前轉化為含氟或含氯、磷等元素的衍生物后進行檢測；④用化學顯色反應來鑒定色譜峰；⑤用扣除法來改進重疊峰的分離等。

反應氣相色譜法在有機分子結構測定方面的主要應用分別介紹如下。

1.反應氣相色譜法測定有機元素

有機樣品（0.5～1mg）在含有少量氧的氦氣流中，在四氧化三鈷和銀的催化劑上瞬間燃燒，生成H2O、CO2和NO，后者再經還原銅爐還原為N2，在PorapakQ填充柱上進行分離，熱導池測定。

如果需要測氧，再另取樣，在另一個爐中進行。使樣品在氦氣流中在活性碳上燃燒成CO后，在分子篩填充柱上色譜分離（可能伴隨有N2、CH4等峰），熱導池測定。

可以自動進樣，分析一個C、H、N樣品只需10min，分析一個氧樣品只需8min。分析數據可用積分儀自動打字機處理。

圖1-33所示為MOD-1104型CHNO自動分析儀結構示意圖，圖中顯示出了典型的C、H、N峰色譜圖。

2.反應氣相色譜法測定有機官能團

（1）活潑氫的測定：將樣品與甲基碘化鎂或氫化鋰鋁反應，產生的甲烷或氫氣經色譜測定，計算樣品中活潑氫含量：

儀器如圖1-34（a）、（b）所示。

色譜條件：色譜柱為ф4mm×2000mm不銹鋼柱，內填裝涂漬有己二酸乙二醇聚酯固定液的6201擔體（60/80目）。固定液與擔體質量比為15:85，維持柱溫為50℃。載氣N2先經105號脫氧分子篩除去痕量氧，再經過CaCl2和P2O5除去水分，然后通入色譜柱，流速60mL/min，熱導池溫度75℃，橋流130mA。

操作：自反應器進樣口注射入4mL甲基碘化鎂乙醚溶液（4mol/L）。注入50μL樣品溶液，反應2min后，將產生的甲烷由載氣載入色譜柱進行分析。以苯甲酸為基準物，繪制標準曲線，計算樣品中活潑氫含量。

（2）羥基的測定：可用上述活潑氫測定法來測定。

（3）伯氨基的測定：將含伯胺樣品與亞硝酸反應，產生的N2用色譜法測定：

色譜條件：色譜柱為ф4mm×2000mm不銹鋼柱，內填裝5A分子篩（40～60目），柱溫50℃，載氣H2流速60mL/min，熱導池檢測器溫度75℃，橋流130mA。

操作：反應器同上，稱取1～5mg試樣放入反應瓶中，加入0.3mL飽和NaNO2溶液。待基線穩定，切斷反應器載氣流。注入0.15mL冰醋酸，反應1min。將反應的氣體產物經MnO2吸收柱以扣除副產物NO后送入色譜柱分析。用甘氨酸作基準物，繪制標準曲線，計算樣品中伯氨基數。

表1-10列舉了用反應氣相色譜法測定有機官能團的示例。

3.高聚物裂解色譜鑒定

其原理是：在仔細控制的條件下，將樣品放在裂解器內升溫，使之迅速裂解成可揮發性的小分子，即“裂解碎片”，用氣相色譜法分離，分析這些裂解碎片，從色譜圖的特征來推斷樣品的組成、結構和其他性質，如熱穩定性等。

裂解色譜法具有下列特點：①設備比較簡單，價格較廉，可得到結構信息。質譜雖然也是很有用的測定高聚物結構的工具，但比裂解色譜儀器復雜昂貴得多。②取量少，快速，靈敏，分離效率高。一般數百微克樣品即可分析，半小時內可完成一個分析周期，由于與高效色譜柱和高靈敏度檢測器相匹配，對于結構相似（如同系物）或同類高分子之間的微小差異，材料中的少量組分等，裂解色譜法都能靈敏地檢驗出來。③在進行裂解反應時，無論是黏稠液體、粉末、薄膜、纖維及彈性體等各種物理狀態的高分子樣品，都能方便地處理和進樣，材料中若存在無機填料和少量小分子添加物（如增塑劑、防老劑等）并不影響分析結果。因此，通常不必事先進行分離純化等手續，對于已固化的樹脂、涂料、硫化橡膠等不熔融材料均可直接進料分析。這在紅外光譜分析或其他波譜法分析時是難以做到的。

但是，裂解色譜也有它的局限性，由于裂解反應復雜，分析結果受實驗條件影響很大，重復性較差，在定性鑒定方面尚無法得到象紅外光譜那樣通用的標準圖譜，由于精密度差，用于定量分析方面尚不令人滿意。

常用于裂解色譜的裂解器有下列幾類。

（1）爐式（或管式）裂解器：結構如圖1-35所示，由石英管（內徑5～8mm）和外圍加熱的電爐構成。樣品放在鉑或金質小舟內。當電爐加熱到所選擇的裂解溫度時，借推桿將樣品推送到電爐的加熱區進行裂解。爐溫借溫度控制器控制，由熱電偶（焊接在樣品舟托盤底部）隨時測定。石英管通入色譜柱一端，填一些石英棉用以除去某些高沸點“碎片”。

管式裂解器的優點是：①爐溫可連續調節、穩定控制和測量，溫度重復性較好；②適應各種狀態的樣品，而且樣品稱量、殘渣稱量和清除方面都很方便。但它有下列缺陷：①因加熱區較長，二次反應嚴重；②TRT（Temperature Rise Time，即使樣品達到某一裂解溫度的時間）大，通常樣品上升至500℃約需4s的時間，二次裂解反應因而容易發生，因此裂解重復性差；③死體積比其他種類裂解器要大，影響色譜峰形和分離效果。爐式裂解器一般用于鑒定（與相同條件下測得的標準樣品裂解指紋圖對照），也間或用于定量分析，但受二次反應的限制，不適于進行結構的分析。

（2）熱絲裂解器：圖1-36是熱絲裂解器的一種。其中將鉑絲或鎳鉻絲繞成線圈作為發熱元件，線圈固定在玻璃磨口塞上，樣品附著線圈上，連同線圈一起插入裂解室。通電后熱絲很快被加熱至所需溫度，樣品立即被裂解，產生的“碎片”隨載氣導入色譜系統（載氣用四通活塞切換）。樣品裂解后立即切斷電源。通電時間用時間繼電器控制，熱絲溫度用已知熔點的晶體來測定。

對于可溶性樣品，用熱絲沾取樣品溶液，待溶劑揮發后，便能在熱絲上均勻涂漬成膜；對于不溶性樣品，可將樣品裝在一小段石英毛細管內，石英毛細管插入線圈中裂解。

熱絲裂解器的優點是：結構簡單，制作容易，裂解室的環境溫度低，死體積小。缺點是：TRT長（數秒鐘）；溫度不易測定；熱絲反應多次會老化，幾何形狀也易改變，因而影響加熱的重現性；并且由于熱絲直接與樣品接觸，對某些反應可能還有催化副作用，使結果復雜化；處理不溶樣品及清除殘渣較不方便。

（3）居里點裂解器：鐵磁性物質處在高頻交變磁場中其磁矩隨磁場方向的變化而運動，磁滯損耗就變成熱，因而磁鐵體本身能迅速升溫。當升到某一溫度時，鐵磁性物質便從鐵磁體變成順磁體，不再吸收磁場的能量，因此溫度不再上升。這一點溫度就叫做居里點溫度。這種方法可使鐵磁物質（發熱元件）迅速發熱并維持在一個恒定的溫度上。這就是居里點裂解器的原理。隨著鐵磁物質組成不同，居里點溫度也不一樣，據此可以得到一系列溫度。

通常將鐵磁性物質制成0.5mm的絲（也有制成箔狀和毛細管狀的），作為發熱元件，并承載樣品。對于可溶性樣品的涂漬和制備方法，與熱絲裂解器相同。對于不溶性樣品，可將合金絲敲成帶狀，夾注樣品薄片進行裂解。裂解器的結構如圖1-37所示。

居里點裂解器的最大優點是：升溫速度快，升溫速率視電源的功率不同，從幾十毫秒到1.5s，而且平衡溫度可精密控制和嚴格重復，使裂解結果的重復性大大提高；同時，樣品受熱方式是內熱式，因此“碎片”與熱以同一方向向冷區擴散；當裂解結束時，加熱也就停止；環境溫度較低；使二次反應的幾率減少。因此它是最理想的裂解器，特別是在定量分析和微觀結構分析研究中更顯出它的長處。但它也有些不足，如分析不溶性樣品時，處理比較困難，將固體樣品直接夾在合金箔上裂解，使樣品受熱不均勻，影響實驗結果。因為裂解室體積小（毛細管），毛細管壁溫度低，裂解碎片往往容易凝集在管壁處。另外，裂解溫度的選擇受合金組成的限制，不能任意和連續調節，合金絲也可能起催化作用，使結果復雜化。

（4）激光裂解器：激光裂解在原理上和熱裂解一樣，不同的是樣品通過激光能的照射升溫裂解。激光裂解器的結構如圖1-38所示。從脈沖激光器所發射出來的光束，經過透鏡聚焦后，照射到樣品室內樣品表面，樣品獲得激光能而瞬間升溫裂解。由于激光束具有極大的能量密度，加熱樣品可獲得106℃/s，因此TRT僅用100～500μs，比任何裂解方式都快，是唯一能與高分子裂解速度相適應的加熱方式。因為樣品在這樣短的時間內發生裂解，二次反應降低到最低限度，而且系統的死體積小，可得到比較簡單的裂解色譜圖。

圖1-39是用管式爐裂解器、熱絲裂解器和用CO2激光裂解器分別裂解聚苯乙烯的裂解圖，可看出后者裂解圖比較簡單，而CO2激光裂解器裂解產物中占優勢的是高聚物的單體，比較清楚地反映了母體化合物的結構特征，這對鑒定高聚物，特別是共聚物的分析有利。

4.碳骨架測定

利用反應氣相色譜法測定有機分子碳骨架又稱為碳骨架色譜。它的原理是：利用比較溫和的催化氫化、氫解或脫氫反應，使未知樣品保留基本的碳骨架，轉化為已知的簡單化合物，推斷未知物的結構。

碳骨架色譜的反應柱裝在色譜柱的前面，結構如圖1-40所示。反應柱可以用硬質玻璃、石英制成，內徑約4mm，長度在8～15cm之間，管頭的隔膜進樣口供液體樣品注射進樣用，側管供固體樣品進樣用。固體樣品可置于鎳制小舟或微坩堝（約ф3mm×3mm）中，借磁鐵吸引。反應柱的加熱（280～350℃）可采用電烙鐵芯子，載氣的流速約20～60mL/min。

催化劑是1％鈀/硅藻土：以PdCl2溶于5％醋酸中，再加入適量的硅藻土擔體而成。有時要加入一些碳酸鈉以中和釋出的鹽酸。干燥后，將催化劑裝入柱中，加熱通氫（200℃）約1h。

在分析胺類時，Na2CO3宜多加一些。對于分子量較大的物質，反應柱可適當短一些（約8cm）。一般進樣量是10～30μg，最多不宜超過1mg。

碳骨架色譜的規律是：

醇　R-┆-CH2OH→RH（RCH3）

醛　R-┆-CHO→RH（RCH3）

酸　R-┆-COOH→RH（RCH3）

醚　R-┆-CH2—O-┆-CH2—R'→RH，RCH3，R'H（R'CH3）

酯　R-┆-COO-┆-CH2-┆-R'→RH，RCH3，R'H（R'CH3）

胺　R-┆-CH2-┆-NH2→RH（RCH3）

酰胺

鹵化物　R—CH2-┆-X→RCH3

硫化物　R—CH2-┆-S-┆-CH2R'→RCH3，R'CH3

仲醇

仲胺

上述各類化合物得到的產物是相同碳原子或少一個碳原子的烷烴，反應溫度約300℃。在350℃的反應溫度下，環狀化合物，如環烷烴，會脫氫而成芳香烴。

碳骨架色譜的反應產物較簡單，便于利用保留值來鑒定，對于有機物結構的測定能提供有用的信息。它曾成功地應用于鑒定殘留在生物物質中的殺蟲劑、鑒定甾體、倍半萜以及石油中的含硫物質等。

反應柱中所用催化劑，不僅可以用Pd，也可以用Pt、Rh（錸）、Ru（釕）、Ni等。在用Ni（1％～3％）為催化劑時，不發生氫解反應，僅是氫化，這對于鑒定不飽和化合物很有用。