第二節 藥物含量測定方法
《中國藥典》正文品種的含量測定或定量檢查項以所收載的用于藥物含量、溶出或釋放量測定的定量分析方法主要包括:容量分析法、光譜分析法和色譜分析法。
一、容量分析法
容量分析法(也稱滴定法),是將已知濃度的滴定液(標準物質溶液)由滴定管滴加到被測藥物的溶液中,直至滴定液與被測藥物反應完全(通過適當方法指示),然后根據滴定液的濃度和被消耗的體積,按化學式計量關系計算出被測藥物的含量。
當滴定液與被測藥物完全作用時,反應達到化學計量點,在進行容量分析時,當反應達到化學計量點時應停止滴定,并準確獲取滴定液被消耗的體積。在滴定反應過程中常常借助指示劑的顏色或電子設備的電流或電壓變化來判斷化學計量點。
酸堿滴定法是容量分析中最基本的、應用最廣泛的定量分析方法之一。在藥品含量測定方法中可以用于酸性、堿性以及能與酸堿直接或間接反應的藥物。
(1)直接滴定法 用滴定液直接滴定被測物質溶液的方式,是最基本、最常用的滴定方式。如阿司匹林原料藥、苯巴比妥原料藥的含量測定。
【例1-1】 阿司匹林原料藥的含量測定
取本品約0.4015g,精密稱定,加中性乙醇(對酚酞指示液顯中性)20ml溶解后,加酚酞指示液3滴,用氫氧化鈉滴定液(0.1021mol/L)滴定,終點時消耗22.78ml。求阿司匹林的百分含量。已知每1ml氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)相當于18.02mg的C9H8O4。
式中 V——氫氧化鈉滴定液消耗的體積,mL;
T——滴定度(18.02mg/ml);
F——滴定液濃度校正系數;
m——供試品取樣質量,單位g。
阿司匹林的百分含量
(2)間接滴定法 本法是先加入定量過量的滴定液A,使其與被測藥物定量反應,待反應完全后,再用另一滴定液B回滴定反應后剩余的滴定液A。在計算百分含量時,需考慮滴定過程中是否進行空白試驗校正。如司可巴比妥鈉、維生素C的含量測定。
【例1-2】 司可巴比妥鈉的含量測定
精密稱取司可巴比妥鈉0.1053g,置250ml碘瓶中,加水10ml,振搖使溶解,精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml,再加鹽酸5ml,立即密塞并振搖1min,在暗處靜置15min后,注意微開瓶塞,加碘化鉀試液10ml,立即密塞,搖勻后,用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定,至近終點時,加淀粉指示液,繼續滴定至藍色消失,并將滴定的結果用空白試驗校正。每1ml滴定液(0.05mol/L)相當于13.01mg的司可巴比妥鈉(C12H17N2NaO3)。已知樣品消耗硫代硫酸鈉滴定液(0.1003mol/L)17.10ml,空白消耗硫代硫酸鈉滴定液(0.1003mol/L)25.12ml。
式中 V0——空白試驗回滴定所消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積,ml;
V——供試品回滴定所消耗硫代硫酸鈉滴定液的體積,ml;
T——滴定度(13.01mg/ml);
F——滴定液濃度校正系數;
m——供試品取樣質量,g。
知識拓展
容量分析法的特點
本法所用儀器價廉易得,操作方法簡便;影響本法測定的實驗條件和環境因素少,方法耐用性高;測定結果準確,相對誤差在0.2%。
本法廣泛應用于化學原料藥物的含量測定。
二、光譜分析法
光譜分析法是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內的吸光度或發光強度,對該物質進行定性和定量分析的方法。《中國藥典》收載的光譜分析法有:紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、原子吸收分光光度法等,本節主要介紹紫外-可見分光光度法。
物質在光吸收過程中,基于分子中電子能級的躍遷而產生的光譜,稱為紫外-可見吸收光譜,利用紫外-可見吸收光譜進行定性和定量分析的方法稱為紫外-可見分光光度法。
1.基本原理
當一束平行單色光垂直通過溶液時,溶液對光的吸收程度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。這就是分光光度法定量分析的基礎,即朗伯-比耳定律。其關系式如下:
式中 A——吸光度;
T——透光率,%;
L——液層厚度,cm;
E——吸收系數,常用的是百分吸收系數(),其物理意義為當溶液濃度為1%(g/ml),液層厚度為1cm時的吸光度值;
c——100ml溶液中所含被測物質的量(按干燥品或無水物計算),g。
2.儀器的基本結構
各種型號的紫外-可見分光光度計,就其基本結構來說,都是由五個基本部分組成,即光源、單色器、吸收池、檢測器和數據記錄處理系統。示意如圖1-1所示。

圖1-1 紫外-可見分光光度計的基本結構示意圖
(1)光源 光源的作用是提供激發能,使待測分子產生光吸收。分光光度計中紫外光區常用氫燈、氘燈,可見光區常用鎢燈、碘鎢燈。
(2)單色器 單色器是能從復合光中分出波長可調的單色光的光學裝置,其性能直接影響入射光的單色性從而影響到測定的靈敏度、選擇性及準確性等。單色器由入射狹縫、準光器、色散原件、聚焦元件和出射狹縫等幾個部分組成。示意圖見圖1-2。

圖1-2 單色器結構示意圖
(3)吸收池 吸收池是用于盛放液態樣品的器皿,是光與物質發生作用的場所,因此,要求吸收池能允許入射光束通過。吸收池分為玻璃池和石英池兩種,玻璃池只能用于可見光區,石英池可用于可見光區及紫外光區。
(4)檢測器 檢測器是用于檢測單色光通過溶液后透射光的強度,并把這種光信號轉變為電信號的裝置。檢測器有光電池、光電管和光電倍增管。光電倍增管的結構示意圖見圖1-3。

圖1-3 光電倍增管結構示意圖
(5)數據記錄處理系統 信號處理和顯示系統給出透光率T(%)或者吸光度A的數值。
3.在含量測定中的應用
(1)對照品比較法 分別配制供試品溶液和對照品溶液,對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規定量的100%±10%,所用溶劑也應完全一致,在規定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后,按下式計算供試品中被測溶液的濃度:
式中 cX——供試品溶液濃度;
cR——對照品溶液濃度;
AX——供試品溶液的吸光度;
AR——對照品溶液的吸光度。
【例1-3】 奧沙西泮的含量測定
精密稱定奧沙西泮0.0157g,置200ml量瓶中,加乙醇150ml,于溫水浴中加熱,振搖使奧沙西泮溶解,放冷,用乙醇稀釋至刻度,搖勻,精密量取5ml,置100ml量瓶中,用乙醇稀釋至刻度,搖勻,在229nm的波長處測定吸光度為0.484;另精密稱取奧沙西泮對照品0.0149g,同法操作,在229nm的波長處測定吸光度為0.466;藥典規定本品按干燥品計算,含C15H11ClN2O2應為98.0%~102.0%。問該供試品含量是否合格?
98.6%>98%,所以供試品合格。
(2)吸收系數法 配制供試品溶液,在規定的波長處測定其吸光度,再以該品種在規定條件下的吸收系數計算含量。
【例1-4】 維生素B12的水溶液在361nm處的值是207,盛于1cm吸收池中,測得溶液的吸光度為0.414,則溶液濃度是多少?
知識拓展
光譜分析法的特點
本法簡便易行,使用的儀器價格較低廉,操作簡單,易于普及;靈敏度高,可達10-7~10-4g/ml,適用于低濃度試樣的分析;準確度較高,但專屬性較差。
本法適用于藥物制劑的含量測定。
4.注意事項
①空白溶液與供試品溶液必須澄清,不得有渾濁。如有渾濁,應預先過濾,并棄去初濾液。
②測定時,除另有規定外,應以配制供試品溶液的同瓶溶劑為空白對照,采用1cm的石英吸收池。
③在測定時或改測其他檢品時,應用待測溶液沖洗吸收池3~4次,用干凈綢布或擦鏡紙擦凈吸收池的透光面至不留斑痕(切忌把透光面磨損),放入樣品室每次方向應一致。
④取吸收池時,應拿毛玻璃兩面,切忌用手拿捏透光面,以免粘上油污。使用完后及時用測定溶劑沖凈,再用純化水沖凈,用干凈綢布或擦鏡紙擦干,晾干后,放入吸收池盒中,防塵保存。若吸收池內外壁沾污,用脫脂棉纏在細玻璃棒上蘸上乙醇,輕輕擦拭,再用純化水沖凈。
⑤務必注意經常保持硅膠的干燥,目的是保護光學元件和光電放大器系統不致受潮損壞而影響儀器的正常工作。
⑥儀器經過搬動請及時檢查并糾正波長精度,并應經常校準波長精度。
三、色譜分析法
色譜分離法是根據混合物中各組分的分配系數不同,或被吸附劑吸附能力的不同,將各組分從混合物中分離后選擇性地對待測組分進行分析的方法。按照流動相的不同可以分為液相色譜和氣相色譜。
(一)高效液相色譜法
高效液相色譜法是采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱將待測組分進行分離測定的色譜方法。注入的供試品,由流動相帶入色譜柱內,各組分在色譜柱內被分離,并依次進入檢測器,由記錄儀或數據處理系統記錄色譜信號。
1.基本概念
(1)色譜峰 從被測組分開始進入檢測器至完全流出檢測器所形成的峰形部分稱色譜峰(見圖1-4)。

圖1-4 高效液相色譜圖
(2)峰高(h) 色譜峰頂到基線的垂直距離。
(3)峰寬(W) 從色譜峰兩側拐點上的切線與基線交點之間的距離。
(4)半高峰寬(W1/2) 色譜峰高一半處的寬度。
(5)峰面積(A) 由色譜峰與基線之間所圍成的面積稱為峰面積。
(6)保留時間(tR) 試樣從進樣到出現峰極大值時的時間。
(7)色譜流出曲線的意義 依據色譜峰數可以判斷出樣品中單組分的最少個數;依據色譜保留值進行定性分析;依據色譜峰高或面積進行定量分析;依據色譜保留值或區域寬度可以評價色譜柱的分離效能;依據色譜峰間距可以評價固定相或流動相選擇是否合適。
2.基本原理
待分離物質在兩相間進行分配時,在固定相中溶解度較小的組分,在色譜柱中向前遷移速率較快;在固定相中溶解度較大的組分,在色譜柱中向前遷移速率較慢,從而達到分離的目的。
3.儀器的基本結構
高效液相色譜儀主要由輸液泵系統、進樣器系統、色譜柱、檢測器、記錄器顯示器及數據處理器等組成,見圖1-5。

圖1-5 液相色譜儀的組成示意圖
4.系統適用性試驗
色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復性五個參數。按各品種正文項下要求對色譜系統進行適用性試驗,即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗,必要時,可對色譜系統進行適當調整,以符合要求。
(1)色譜柱的理論板數(n) 用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同,采用理論板數作為衡量色譜柱效能的指標時,應指明測定物質,一般為待測物質或內標物質的理論板數。
n=16(tR/W)2 (1-6)
或 n=5.54(tR/W1/2)2 (1-7)
式中 tR——保留時間;
W——峰寬;
W1/2——半高峰寬。
tR、W、W1/2的單位可用時間或長度計(下同),但應取相同單位。
(2)分離度(R) 用于評價待測物質與被分離物質之間的分離程度,是衡量色譜系統分離效能的關鍵指標。除另有規定外,待測物質色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應大于1.5。分離度的計算公式為:
式中 tR2——相鄰兩峰中后一峰的保留時間;
tR1——相鄰兩峰中前一峰的保留時間;
W1,W2——相鄰兩峰的峰寬。
意義:R值越大,表明兩組分的分離程度越高;R=1.0時,分離程度可達98%;R<1.0時兩峰有部分重疊;R=1.5時,分離程度達到99.7%;所以,通常用R=1.5作為相鄰兩色譜峰完全分離的指標。
(3)重復性 用于評價色譜系統連續進樣時響應值的重復性能。采用外標法時,通常取各品種項下的對照品溶液,連續進樣5次,除另有規定外,其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%;采用內標法時,通常配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液,加入規定量的內標溶液,配成3種不同濃度的溶液,分別至少進樣2次,計算平均校正因子,其相對標準偏差應不大于2.0%。
(4)拖尾因子(T) 用于評價色譜峰的對稱性。除另有規定外,T應在0.95~1.05之間。
式中 W0.05h——0.05峰高處的峰寬;
d——峰極大至峰前沿之間的距離。
5.測定方法
(1)內標法 按品種正文項下的規定,精密稱(量)取對照品和內標物質,分別配成溶液,各精密量取適量,混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量進樣,記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰髙,按下式計算校正因子:
式中 As——內標物質的峰面積;
Ar——對照品的峰面積;
cs——內標物質的濃度,mg/ml;
cr——對照品的濃度,mg/ml。
再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液,進樣,記錄色譜圖,測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高,按下式計算含量:
式中 Ax——供試品的峰面積;
cx——供試品的濃度,mg/ml;
——內標物的峰面積;
——內標物的濃度,mg/ml;
f——校正因子。
采用內標法,可避免因供試品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。
(2)外標法 按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和供試品,配制成溶液,分別精密取一定量,進樣,記錄色譜圖,測量對照品溶液和供試品溶液中待測物質的峰面積(或峰高),按下式計算含量:
式中,各符號意義同上。
由于微量注射器不易精確控制進樣量,當采用外標法測定時,以手動進樣器定量環或自動進樣器進樣為宜。
(3)面積歸一化法 按各品種項下的規定,配制供試品溶液,取一定量進樣,記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積,計算各峰面積占總峰面積的百分率。通過下列公式計算各組分的質量分數:
式中 Ai——各組分的峰面積;
fi——各組分的峰高校正因子。
知識拓展
高效液相色譜法的特點
高壓,對流動相施加高壓,使其迅速地通過色譜柱;高效,分離效率高;高靈敏度,采用高靈敏度的檢測器;速度快,與經典液相色譜法相比,高效液相色譜法所需的分析時間較少,一般少于1h;應用范圍更廣,可以分析80%以上的有機化合物。
(二)氣相色譜法
1.基本原理
氣相色譜法是采用氣體為流動相(載氣)流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。供試品汽化后,被載氣帶入色譜柱進行分離,各組分先后進入檢測器,用數據處理系統記錄色譜信號。分配系數小的組分先流出,分配系數大的組分后流出。
2.儀器的基本結構
氣相色譜儀,由載氣源、進樣器、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統等組成,見圖1-6。

圖1-6 氣相色譜儀的組成示意圖
(1)載氣源 氣相色譜法的流動相為氣體,稱為載氣,氦、氮和氫可用作載氣,可由高壓鋼瓶或高純度氣體發生器提供,經過適當的減壓裝置,以一定的流速經過進樣器和色譜柱;根據供試品的性質和檢測器種類選擇載氣,除另有規定外,常用載氣為氮氣。
(2)進樣部分 進樣方式一般可采用溶液直接進樣、自動進樣或頂空進樣。溶液直接進樣采用微量注射器、進樣閥或有分流裝置的汽化室進樣;采用溶液直接進樣或自動進樣時,進樣口溫度應高于柱溫30~50℃;進樣量一般不超過數微升;柱徑越細,進樣量應越少,采用毛細管柱時,一般應分流以免過載。
頂空進樣適用于固體和液體供試品中揮發性組分的分離和測定。將固態或液態的供試品制成供試液后,置于密閉小瓶中,在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發性組分在液態和氣態達到平衡后,由進樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。
(3)色譜柱 色譜柱為填充柱或毛細管柱。填充柱的材質為不銹鋼或玻璃,內徑為2~4mm,柱長為2~4m,內裝吸附劑、高分子多孔小球或涂漬固定液的載體,粒徑為0.18~0.25mm、0.15~0.18mm或0.125~0.15mm。常用載體為經酸洗并硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球,常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細管柱的材質為玻璃或石英,內壁或載體經涂漬或交聯固定液,內徑一般為0.25mm、0.32mm或0.53mm,柱長5~60m,固定液膜厚0.1~5.0μm,常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。
新填充柱和毛細管柱在使用前需老化處理,以除去殘留溶劑及易流失的物質,色譜柱如長期未用,使用前應老化處理,使基線穩定。
(4)柱溫箱 由于柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結果的重現性,因此柱溫箱控溫精度應在±1℃,且溫度波動小于每小時0.1℃。溫度控制系統分為恒溫和程序升溫兩種。
(5)檢測器 適合氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器(FID)、熱導檢測器(TCD)、氮磷檢測器(NPD)、火焰光度檢測器(FPD)、電子捕獲檢測器(ECD)、質譜檢測器(MS)等。火焰離子化檢測器對碳氫化合物響應良好,適合檢測大多數的藥物;氮磷檢測器對含氮、磷元素的化合物靈敏度高;火焰光度檢測器對含磷、硫元素的化合物靈敏度高;電子捕獲檢測器適于含鹵素的化合物;質譜檢測器還能給出供試品某個成分相應的結構信息,可用于結構確證。除另有規定外,一般用火焰離子化檢測器,用氫氣作為燃氣,空氣作為助燃氣。在使用火焰離子化檢測器時,檢測器溫度一般應高于柱溫,并不得低于150℃,以免水汽凝結,通常為250~350℃。
(6)數據處理系統 可分為記錄儀、積分儀以及計算機工作站等。各品種項下規定的色譜條件,除檢測器種類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外,其余如色譜柱內徑、長度、載體牌號、粒度、固定液涂布濃度、載氣流速、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等,均可適當改變,以適應具體品種并符合系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約于30min內記錄完畢。
3.系統適用性試驗
同高效液相色譜法。
4.測定方法
內標法、外標法、面積歸一化法均同高效液相色譜法。還可以采用標準溶液加入法,具體操作如下。
精密稱(量)取某個雜質或待測成分對照品適量,配制成適當濃度的對照品溶液,取一定量,精密加入到供試品溶液中,根據外標法或內標法測定雜質或主成分含量,再扣除加入的對照品溶液含量,即得供試品溶液中某個雜質和主成分含量。也可按下述公式進行計算,加入對照品溶液前后校正因子應相同,即:
則待測組分的濃度cx可通過如下公式進行計算:
式中 cx——供試品中組分x的濃度;
Ax——供試品中組分x的色譜峰面積;
Δcx——所加入的已知濃度的待測組分對照品的濃度;
Ais——加入對照品后組分x的色譜峰面積。
由于氣相色譜法的進樣量一般僅數微升,為減小進樣誤差,尤其當采用手工進樣時,由于留針時間和室溫等對進樣量也有影響,故以采用內標法定量為宜;當采用自動進樣器時,由于進樣重復性的提高,在保證分析誤差的前提下,也可采用外標法定量。當采用頂空進樣時,由于供試品和對照品處于不完全相同的基質中,故可采用標準溶液加入法,以消除基質效應的影響;當標準溶液加入法與其他定量方法結果不一致時,應以標準加入法結果為準。
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氣相色譜法與高效液相色譜法的異同,見下表:
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